La détection dans le tissu osseux

Dans le tissu osseux, sur les échantillons modernes: Sur les 26 échantillons initiaux, nous n’avons jamais obtenu d’ADN pour un échantillon, et cinq autres étaient identifiés avec un polymorphisme dans la région d’hybridation des sondes digoxigenine.

WT M 23 34 37 46 48 51 71 35* âge (années)

Sonde 189 WT

Sonde 189 M Figure 63: Détection des deux formes A et G en position 189 sur un échantillon osseux moderne

d’un homme âgé de 71 ans.

Dans une première expérience, nous avions un seul individu âgé de plus de 60 ans, et nous pouvons observer que celui-ci présente un marquage pour la position 189G, et que le marquage est absent pour les autres individus de 23 à 51 ans.

Le marquage de la sonde M a été quantifié par le logiciel ImageQuant à 22 % de mutants pour l’individu de 71 ans.

Au sujet de l’individu de 35 ans, marqué d’un astérisque, celui-ci présente deux polymorphismes aux positions 195 et 198, et qui sont des bases incluses dans les extrémités des sondes digoxigenine. L’hybridation ne peut avoir lieu entre les sondes et la séquence ADNmt de l’échantillon, le marquage visualisé pour la sonde WT étant plus faible que le marquage du contrôle M, ce qui démontre qu’il n’est pas spécifique, le temps d’exposition étant très court, seulement de 3 minutes.

WT M 21 26 32 33 44 71 71 105 48 âge (années)

Sonde 189 M Figure 64: Détection des deux formes A et G en position 189 sur des échantillons osseux modernes

d’individus âgés de plus de 70 ans.

Par la suite nous avons obtenu d’autres échantillons osseux, incluant deux individus supplémentaires de 71 et 105 ans. La détection de la mutation 189G est visible sur les 3 individus âgés de plus de 70 ans et absent chez les moins de 44 ans.

L’évaluation du marquage de la sonde 189 M par le logiciel ImageQuant donne des pourcentages de mutants de 25% sur l’échantillon le plus marqué de 71 ans, cet échantillon étant celui analysé dans la figure 63. Pour le deuxième individu de 71 ans, le marquage est quantifié à 13,1% et pour l’échantillon provenant d’une femme de 105 ans, le taux est de 12,5%.

Dans le tissu osseux, sur les échantillons anciens: Sur les 4 échantillons initiaux, 3 ont pu être testés par la technique de Southern blot, les 2 individus âgés Y32 et Y20, et l’individu adulte Y31.

Dans une première expérience:

Après une amplification PCR du segment cible de 160 pb avec 35 cycles et un dépôt de 10 µl de produits PCR pour chaque puits.

WT M Y31 Y32 Y20

Sonde 189 WT

Sonde 189 M

Figure 65: Détection de la forme G sur la position 189 dans un échantillon osseux ancien d’une femme âgée.

Nous constatons rapidement que dans cette première expérimentation, la quantité ADN déposée est trop faible et ne permet pas d’obtenir des résultats corrects. Au niveau des deux contrôles, afin d’avoir la même quantité d’ADN déposée, dans le but d’une quantification à venir par ImageQuant, une dilution au 1/100 a été faite. Ces contrôles ne présentent pas habituellement des problèmes de marquage et donc confirment que c’est bien la quantité ADN trop faible qui est incriminée. On peut néanmoins visualiser un marquage de la sonde M sur le contrôle M et l’échantillon osseux Y20. On distingue très superficiellement le marquage de la sonde WT sur les 3 échantillons.

Pour la deuxième expérience: Après une amplification PCR du segment cible de 160 pb avec 40 cycles et un dépôt de 24 µl de produits PCR dans chaque puits pour chaque échantillon, alors que nous avons toujours déposé 10 µl de produits PCR pour les deux contrôles mais sans faire aucune dilution préalable.

WT M Y31 Y32 Y20

Sonde 189 WT

Sonde 189 M

Figure 66: Détection des formes A et G sur la position 189 dans deux échantillons osseux anciens de deux femmes âgées.

Nous observons le marquage par la sonde M de l’ADN des deux échantillons osseux provenant des deux femmes âgées alors qu’il est absent sur l’individu adulte.

Le marquage de la sonde M est évalué par ImageQuant à 9,2% pour l’échantillon Y32 et à 24% pour l’échantillon Y20.

Au sujet de la sonde WT, le marquage du contrôle WT et de l’échantillon Y31 est absent. Cet absence de marquage n’est pas dû à un problème d’ADN, car l’image enregistrée initialement à partir du gel sous lumière UV démontre que la quantité d’ADN est correcte et même supérieure aux deux autres échantillons. Malheureusement, lors de cette expérience, le four d’hybridation est tombé en panne dans la nuit, et la membrane est restée en partie dans le tampon à une température de 45°C. La partie immergée a été lavée de l’ADN fixé, ceci est visible par une différence de coloration sur l’image (figure 66). Mais nous pouvons constater que l’individu Y32 présente un marquage plus fort pour la sonde WT par rapport à la sonde M, et inversement pour l’individu Y20. Le marquage est donc proportionnel entre les 2 sondes.

Cette expérience complémentaire a été réalisée suite à l’hybridation incomplète de la sonde 189WT de la figure 66. La figure 66bis montre que la sonde WT s’hybride sur tous les échantillons osseux des sujets anciens. L’hybridation de la sonde M est bien spécifique de la position 189G sur la figure 66, le sujet Y31 ne présentant pas de marquage avec cette sonde M, il est détecté par la sonde WT sur cette position (figure 66bis).

Sonde 189 WT

WT M Y31 Y32 Y20

Figure 66 bis: Détection de la forme A sur la position 189 dans les trois échantillons osseux anciens.

L’intensité du marquage du sujet Y32 est le résultat d’une bonne quantité et qualité d’ADN encore disponible pour cet échantillon, les deux autres échantillons présentaient une quantité ADN initiale faible suite à la réalisation des expériences précédentes (incluant deux séquençages et des tests d’amplification et de marquage pour la technique de Southern). La quantité ADN pour le contrôle WT étant elle aussi faible lors de cette expérience.

8. L’analyse statistique

Afin d’évaluer si les différences de taux de mutant entre les individus âgés de moins de 60 ans et ceux de plus de 60 ans sont significatives un test de student est réalisé (logiciel R), sur le

tissu musculaire, à partir des valeurs calculées par la méthode PNA/qPCR sur les 50 échantillons de 1 à 97 ans de la figure 55.

L’âge minimum étant de 1 an et maximum de 97 ans, l’âge moyen de 44, 59 ans. La valeur de t = -6,9019 et la valeur de p = 9,414 e-09.