Les échantillons analysés par PNA/qPCR

Pour tous les échantillons, la variation entre les triplicats d’un même échantillon dans une même expérience devait être inférieure à 0,5 Ct pour être statistiquement représentatif selon les recommandations du fabricant (Applied biosystems). Ainsi les échantillons ne présentant pas une amplification stable lors d’une même expérience sont soit re-analysés soit exclus.

Les échantillons ayant une amplification correcte et stable présente des variations de Ct faibles (≤ à 0,5). Ainsi la précision intra-test mesurés à partir des triplicats de chaque échantillon, provenant des trois types tissulaires, sont inclus entre 0,06% et 1,68% (Gibson et al. 1996).

6.1. La mutation A189G

Dans l’analyse des 23 échantillons buccaux par PNA/qPCR, l’hétéroplasmie en position 189 a été détectée sur 18 échantillons à un niveau supérieur à 5%, le maximum s’élevant à 12,6%

(figure 53).

cellules buccales

0 2 4 6 8 10 12 14

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 âge (années)

% mutants (G)

Figure 53 :Accumulation dans les cellules buccales de l’hétéroplasmie A189G par rapport à l’âge.

La méthode PNA/qPCR a permis d’enregistrer des variations d’amplification avec les sondes PNA G et A dans les échantillons buccaux. L’ensemble des rapports de Ct G/A mesurés n’a jamais dépassé la valeur de 0,92 ce qui a donné une estimation maximum de pourcentage de variant G calculé de 12,6%.

De telles hétéroplasmies étaient notablement observées dans quatre individus (4, 37, 60 et 85 ans) appartenant au même lignage maternel (famille 1 ; figure 54). Tandis que la mutation était détectée dans les trois adultes (dans des niveaux de 7 à 9,5%), elle n’est pas observée pour l’enfant. Similairement l’hétéroplasmie détectée dans les membres âgés de 73 et 80 ans des autres familles (famille 2 et 4), est plus faiblement observé dans les plus jeunes (de 1,5 à 8,9% ; figure 54).

cellules buccales

Figure 54 :Accumulation de l’hétéroplasmie A189G dans les cellules buccales d’individus appartenant à la même lignée maternelle dans trois familles différentes.

Nous pouvons constater, à partir de ces familles et malgré les niveaux faibles de mutation, que la transition A189G sous forme d’hétéroplasmie est une mutation somatique. Au regard de l’ensemble des individus de l’échantillonnage (figure 53) les niveaux d’hétéroplasmies sont très faibles et il n’apparaît pas un âge seuil de mutation spécifique.

Cinquante échantillons musculaires à partir d’individus de 1 à 97 ans sont analysés par la méthode PNA/qPCR. La figure 55 montre l’accumulation de la mutation A189G en fonction de l’âge du sujet étudié.

Figure 55 :Accumulation de l’hétéroplasmie A189G dans le tissu musculaire avec l’âge.

A partir de 50 ans les taux sont majoritairement ≥ à 10% (15/19) et à un âge supérieur à 60 ans les taux sont proches de 20% et plus (10/12). Les individus d’un âge inférieur à 40 ans présentent des pourcentages de mutation ≤ à 10% à l’exception de quelques individus (5/23).

Entre 40 et 50 ans les taux de mutants peuvent varier de 7 à 15%.

Nous notons des niveaux élevés de l’hétéroplasmie A189G dans le tissu musculaire comparé aux échantillons buccaux. En effet, pour les individus de 60 ans et plus, le pourcentage de molécules mutantes est proche de 20% ou supérieur, pour 10 individus sur 12 (contre 12,6 % pour les cellules buccales). Par contre, dans un âge inférieur à 40 ans, les pourcentages de mutation sont faibles, ≤ à 10%, dans 18 individus pour les 23 analysés.

Bien sûr, la méthode PNA/qPCR a aussi détecté les polymorphismes 189G identifiés dans les 6 échantillons buccaux par séquençage (annexe 2 ; tableau 11). Comme attendu, dans les cas de polymorphisme 189G, les valeurs de Ct G/A étaient similaires aux valeurs de Ct G/A du contrôle 100% M (≥ 1,6).

Dix-neuf échantillons osseux modernes ont pu être analysés par la méthode avec les deux sondes PNA. Seulement 3 individus sont identifiés avec un taux de mutant supérieur à 10%, les autres individus, dans des âges compris entre 23 et 51 ans, sont reconnus dans des taux de mutant entre 0 et 8%, mais l’ensemble étant très dissemblable dû au nombre faible d’échantillons, une relation avec l’âge ne peut être mis en évidence avec ces résultats.

Mais nous pouvons noter les résultats pour les deux femmes âgées de 71 ans et de 105 ans, les pourcentages sont de 15,9% et 11,5% respectivement et pour une femme âgée de 71 ans de 29%.

Les échantillons osseux anciens n’ont pas été analysés par la méthode de PNA/qPCR, car les volumes et les concentrations initiales sont trop faibles pour cette technique. C'est-à-dire, la technique qPCR est très sensible et peut faire des enregistrements d’amplification dans des concentrations faibles, mais au niveau des volumes (40 µl) plus aucune autre technique ne pourra être appliquée. Nous avons donc fait le choix de conserver ces échantillons pour les techniques de séquençage automatique et de Southern blot où les volumes requis sont peu important (1 à 2 µl pour chaque expérience).

La variation inter-test entre toutes les expérimentations sur les échantillons a été évaluée sur les contrôles WT et M. La précision inter-test calculée en pourcentage est comprise entre 1,75 et 3% pour les amplifications sans sonde, entre 5 et 8% avec la sonde PNA G et entre 2,5 et 6,7% avec la sonde PNA A.

6.2. Les mutations T408A et T414G

Nous vous rappelons que pour les mutations 408 et 414, une seule sonde a été synthétisée pour la forme WT (PNA 408T et PNA 414T).

Les analyses menées sur les positions 408 et 414 par la technique PNA/qPCR mettent en évidence un premier point. La différence entre l’amplification sans sonde et avec la sonde PNA (ΔCt) est beaucoup plus importante pour ces deux positions, de l’ordre de 20 cycles par rapport à la position 189 (de 10 cycles).

Cette différence de blocage de l’amplification PCR peut s’expliquer par la séquence de chaque sonde. En effet, il est conseillé par le fabricant (Eurogentec) de limiter la contenance en purines (les bases Adénine et Guanine) à un taux inférieur à 60%. Pour les sondes PNA 408 et 414, synthétisées sur 15 bases, la contenance en purines est de 40% et 46%

respectivement, par contre les sondes PNA 189 contiennent plus de 53% de purines, entraînant un blocage moins efficace dans le nombre de cycles de l’amplification PCR. Ce blocage plus important pour les sondes PNA 408 et 414 nécessite, lors des amplifications en qPCR, un nombre de cycles total de 45 pour permettre l’analyse de l’amplification avec les sondes.

Comme expliqué dans le paragraphe Méthode (2.7), aucun échantillon ne présente un polymorphisme de base A à la position 408 et de base G à la position 414 pour jouer son rôle de contrôle M. Nous ne pouvons donc pas construire une échelle de mutants pour ces 2 positions comme pour la position 189. Mais nous pouvons penser que le blocage de l’amplification suit le même schéma malgré des ΔCt beaucoup plus grands. Ainsi si l’on se réfère à la figure 50, qui représente le blocage des formes WT avec la sonde WT sur la position 189, la plus grande variation de cycles entre l’amplification sans PNA et avec PNA se situe dans les taux de mutants < à 20%. Il est donc possible d’évaluer des taux de mutants <

à 20% par des grandes différences de ΔCt, ceci par rapport au contrôle WT et par rapport au Ct sans sonde de l’échantillon même.

En ce qui concerne la position 408, 49 échantillons musculaires (d’âge inclus entre 19 et 97 ans) sont soumis à l’amplification par PCR en Temps Réel sans et avec la sonde PNA 408.

Trois individus de 54 à 64 ans sont enregistrés avec un ΔCt de 11 à 12 cycles par rapport au ΔCt de référence de 20 cycles, permettant une estimation vraisemblable d’environ 10% de mutants 408A.

Aucunes différences ne sont enregistrées dans l’amplification des ADNmt provenant des échantillons de cellules buccales ou d’os modernes par rapport au contrôle de référence.

Sur l’ensemble des échantillons musculaires (62) d’individus d’un âge inclus entre 14 et 97 ans analysés par PNA/qPCR sur la position 414, seulement 3 échantillons ont des ΔCt de l’ordre de 15 cycles par rapport à la majorité de 20-22 cycles. Ce sont des individus d’âge de 52 et 54 ans, nous pouvons donc suspecter la présence de la mutation 414G, mais dans des taux faibles, ≤ à 10% ou 5% au vu de la variation des cycles.

De même, les échantillons buccaux (22) ont été analysés sur la position 414, on note un ΔCt de 15 pour 3 individus de 60, 80 et 85 ans, nous questionnant sur la présence de la mutation 414G.

Au niveau des échantillons osseux modernes, aucuns ne révèlent de différence d’amplification avec la sonde PNA 414.