1. Extraction des ARN totaux.
Afin d’évaluer le niveau d’expression des ARNm codant pour la Cx43, la Cx45, la Cx26, OCN, Cbfa1, OPN, OPG et le RANKL, les cellules ont été ensemencées dans des boîtes de Pétri de 35 mm de diamètre. Par la suite, l’extraction des ARN totaux a été effectuée
à différents temps grâce au kit SV total RNA isolation (Promega, Madison, Etats-Unis) où 175 μL de RNA lysis buffer est ajouté afin de lyser les cellules. Après avoir récupéré les ARNm sur la colonne du kit puis digéré l’ADN par la DNAse1 du kit, les ARNm ont été élués avec 50 μL d’eau sans nucléases et peuvent être conservés à -80°C.
Les échantillons ont été déposés avec du Bleu de Bromophénol sur un gel d’agarose de 1% afin de vérifier la présence et la pureté des ARN.
2. Transcription inverse.
La transcription inverse se fait à partir des ARN totaux précédemment extraits. La technique appliquée est basée sur l’utilisation d’hexamères de six nucléotidiques aléatoires qui vont se fixer sur l’ARN afin d’effectuer la synthèse d’ADNc. Pour amorcer l’hybridation et éliminer les structures secondaires, les hexamères (Invitrogen) ont été mis en présence des ARN pendant 5 min à 70°C puis à 4°C pendant 3 min. Par la suite, le prémix composé de 4 μL de tampon 5X, 1 μL de DTT (Dithiothreitol), 1 μL de dNTPs (10 mM, Promega) et 1 μL de l’enzyme SuperScriptII (transcriptase inverse) ont été ajoutés à 12,3 μL d’ARN.
Les échantillons ont été ensuite mis dans un thermocycleur et traités selon le programme suivant :
• 25°C pendant 10 min pour activer l’enzyme.
• 42°C pendant 50 min pour avoir un fonctionnement optimal de l’enzyme et réaliser l’élongation du brin d’ADNc.
• 95°C pendant 15 min pour permettre la séparation de l’ARN de l’ADNc néosynthétisé.
Les ADNc peuvent être conservés à -20°C.
3. La PCR quantitative en temps réel.
La réaction d’amplification a été faite dans une plaque 96 puits, permettant de faire une PCR sur plusieurs échantillons en même temps. La quantification de produit amplifié à chaque cycle a été faite par détection de la fluorescence grâce à l’appareil GeneAmp7500 Fast (Applied Biosystems), relié à un ordinateur qui a soumis la plaque à :
• 50°C pendant 2 min pour activer l’UNG ampérase.
Gène Spécificité des espèces
Orientation
des amorces Séquence des amorces (5’ > 3’)
Taille amplicon GAPDH NM_002046 - Sens GGCTCTCCAGAACATCATCCCTGC 269pb Antisens GGGTGTCGCTGTTGAAGTCAGAGG Cx43 NM_000165 - Sens GCTGGTGGTGTCCTTGGTGTC 215pb Antisens CAGGAGGAGACATAGGCGAGAGG Cx26 NM_004004 - Sens TGGTGAGGTTGTGTAAGAGTTGGTG 240pb Antisens TGAAGAGGACGGTGAGCCAGATC Cx32 NM_000166 - Sens GTCATCTTCATCTTCAGAATCATGG 243pb Antisens CCGTAGCATTTTCTTCTCTATGTGT Cx45 NM_005497 - Sens TCCTTGTCCTCATAAGATAGACTGC 218pb Antisens ATGGTGTATTCCAAGTGAAAGGATA GAPDH NM_008084 Souris Sens AGCATCTCCCTCACAATTTCCA 102pb Antisens GTGCAGCGAACTTTATTGATGGTAT Cx43 NM_010288 Souris Sens TCCACCACTTTGGCGTGCCG 121pb Antisens CTCCGGCCGTGGAGTAGGCT ALP NM_007431 Souris Sens TCGCTATCTGCCTTGCCTGTA 102pb Antisens AAGAGAGAAACCTGCTGGCCA OCN NM_007541 Souris Sens CTGGCTGCGCTCTGTCTCT 82pb Antisens CCTGCTTGGACATGAAGGC OPN NM_009263 Souris Sens CGATGTCATCCCTGTTGCC 81pb Antisens TGACTTGACTCATGGCTGCC Cbfa1 NM_009820 Souris Sens AAACATCTCCACACCATTAGAGGTT 78pb Antisens GTCAGTCAGTGCCTTTCCTCC RANKL NM_011613.3 Souris Sens TGGAAGGCTCATGGTTGGAT 74pb Antisens CATTGATGGTGAGGTGTGCAA OPG NM_008764.3 Souris Sens TGTGTGTCCCTTGCCCTGACCA 131pb Antisens ACACTCGGTTGTGGGTGCGG
• 40 cycles pendant 2h30 (90°C pendant 15 sec pour la dénaturation, 60°C pendant 1 min pour les phases d’hybridation et d’élongation).
L’analyse de la courbe de fusion (augmentation progressive de la température à partir de 60°C jusqu’à 95°C toutes les 30 sec) a été réalisée en fin de chaque expérience afin de vérifier qu’un produit unique par paire d’amorces a été amplifié.
Le volume final de mélange réactionnel est de 20 μL par puits contenant 5 μL d’ADNc (dilués au préalable au 1/10ème) et 15 μL de Mix : 4,8 μL eau, 0,1 μL de chaque amorce à 25 mM, 10 μL de SYBRGREEN PCR Master Mix (Applied Biosystems) contenant l’agent intercalant fluorescent, la Taq polymérase, les dNTPs ainsi que les sels.
4. Analyse des résultats.
A partir des courbes de fluorescence, il est possible de connaître le cycle correspondant à l’amplification détectable du matériel génétique : Ct (cycle threshold ou cycle seuil). Préalablement, une normalisation du gène d’intérêt par rapport à un gène endogène de référence dont l’expression reste constante est réalisée. Le gène de référence utilisé est celui de la protéine GAPDH. La normalisation se fait en calculant la différence des Ct telle que ǻCt = Ct gène intérêt-Ct gène de référence, pour en déduire l’expression relative du gène d’intérêt par rapport au gène de référence : % GAPDH = 2-ǻCt x 100. Ce calcul a été effectué pour chacune des conditions et des gènes d’intérêt utilisés lors des analyses. Afin de comparer l’expression du gène d’intérêt dans différentes conditions, la valeur relative de 1 (ou 100%) a été attribuée à la condition contrôle et les valeurs relatives des autres conditions ont été calculées en référence de celle-ci.
5. Validation des amorces murines.
Afin d’étudier l’impact en co-cultures des cellules cancéreuses prostatiques sur la différenciation des ostéoblastes murins et principalement sur l’expression génique de certains marqueurs ostéoblastiques, l’utilisation d’amorces spécifiques murines a été nécessaire. Pour cela, chaque couple d’amorces, cité dans le tableau 7, a été testé.
mOB ADNc hOB ADNc Gel d’agarose Amplification qPCR Amplification qPCR A B C Courbe de fusion Analyse de la spécificité murine sur Blast
Séquençage
Figure 30 : Résultats obtenus pour la validation des amorces spécifiques murines par PCR quantitative en temps réel. Exemple pour mCbfa1.
A) Courbe de fusion (gauche) et courbe d’amplification (droite) obtenue avec les matrices murines et humaines. B) Vérification de l’amplification linéaire par dilution des matrices murines au 1/10ème, 1/100ème, 1/1000ème. La droite, correspondant au Ct (cycle threshold ou cycle seuil) en fonction du log10 des dilutions, doit avoir une pente se situant entre 3.1 et 3.4. C) Vérification des amplicons, obtenus suite à l’amplification, par migration sur gel d’agarose 2% et séquençage sur Blast.
Plusieurs paramètres ont été vérifiés :
• Une PCR quantitative en temps réel a été effectuée avec des ADNc issus d’ostéoblastes murins et humains afin de vérifier que le couple d’amorces amplifie uniquement la matrice spécifique (Figure 30A).
• Afin de vérifier l’efficacité de l’amplification linéaire (Figure 30B), des dilutions successives au 1/10ème des matrices ont été effectuées et chaque matrice a été amplifiée par PCR quantitative en temps réel. Sachant qu’à chaque cycle, la quantité d’ADN est doublée, cela signifie que pour une dilution au 1/10ème, 2n=10 donc n=3.3. La droite, correspondant au Ct en fonction du log10 des dilutions, doit avoir une pente se situant entre 3,1 et 3,4.
• Il a fallu vérifier la spécificité de l’amplification grâce à la courbe de fusion et à une analyse par électrophorèse des amplicons sur gel d’agarose à 2% (Figure 30C). La bande obtenue est extraite, puis l’ADN a été extrait à l’aide du kit QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Pour cela, le gel contenant la bande correspondant aux amplicons a été découpé et le tout a été suspendu dans le tampon QG du kit puis chauffé 10 min à 50°C afin de le solubiliser. Après plusieurs centrifugations et lavage à l’éthanol, les amplicons ont été élués dans 50 μL d’eau milliQ. La réaction de séquence a été effectuée selon la méthode de Sanger avec des DDnucléotides fluorescents et le kit BigDye® Terminator v3.1 (Applied Biosystems). Pour ce faire, 2 μL d’amplicons ont été ajoutés à 1 μL d’amorce à 1,6 μM, 2 μL du kit BigDye® Terminator v3.1 et 5 μL d’eau. Le séquençage a été analysé à l’aide du séquenceur 3130 Genetic Analyser (Applied Biosystems) et les séquences obtenues ont été vérifiées dans la base de données Blast.