Mesure de la communication jonctionnelle 86 

Afin d’évaluer la communication jonctionnelle, deux techniques ont été employées : • la technique de précharge qui est une méthode qualitative.

DiLC18(3)

Cellules donneuses

Calcéine/AM

20 min de charge

Cellules donneuses déposées sur les cellules receveuses

Après 4h, observation au microscope confocal

Communication _{Pas de} Communication

Figure 31 : Représentation schématique du principe de la méthode de précharge.

Les cellules donneuses sont chargées 20 min en présence de 5 μM de calcéine (diffusible) et de 10 μM de DiLC18(3) (marqueur membranaire). Mille cellules donneuses sont déposées sur les cellules receveuses cultivées à confluence. L’observation de la diffusion ou non de la calcéine des cellules donneuses aux cellules receveuses est effectuée 4h après au microscope confocal.

Des sondes fluorescentes ont été utilisées dans les deux cas et doivent présenter certaines caractéristiques. D’une part, elles doivent être hydrophiles une fois qu’elles ont pénétré à l’intérieur de la cellule et doivent être de faible poids moléculaire (< 1000 Da) pour passer à travers les jonctions communicantes. D’autre part, elles doivent être détectables à faible concentration, ne pas avoir d’activités biologiques, rester stables lors de la phase d’acquisition et avoir une perméabilité membranaire réduite.

1. La technique de précharge (méthode qualitative).

La technique de précharge (Figure 31) permet de mettre en évidence une communication homo ou hétérocellulaire. Concernant l’étude de la communication homocellulaire, les cellules cancéreuses prostatiques ont été ensemencées dans des boites de Pétri de 35 mm de diamètre à 3.104 cellules/mL. Après 4 jours de culture, lorsque les cellules ont atteint la confluence, une partie des cellules, appelées cellules donneuses, a été incubée pendant 20 min avec du Tyrode (NaCl 144 mM ; KCl 5,4 mM ; CaCl2 2,5 mM ; NaH2PO4 0,3

mM ; Hepes 5 mM ; Glucose 5,6 mM ; pH 7,4) contenant 10 μM de DiIC18(3) (1,1ƍ-

dioctadecyl-3,3,3ƍ,3ƍ-tetramethylindocarbocyanine perchlorate, Invitrogen) et 5 μM de calcéine/AM (Sigma). Le DilC18(3) est un marqueur membranaire qui permet d’identifier les

cellules donneuses, alors que la calcéine/AM, après clivage de son domaine hydrophobe AM (Acétoxyméthylester) par des estérases cytoplasmiques, peut diffuser au travers des jonctions communicantes du fait de son faible poids moléculaire (622 Da).

Après avoir été rincées avec du Tyrode, les cellules donneuses ont ensuite été décrochées à l’aide de trypsine-EDTA puis 1000 d’entre elles ont été déposées sur les cellules receveuses. Quatre heures plus tard, les cellules ont été observées au microscope confocal (FV 1000 Olympus IX-81, Tokyo, Japon), objectif x40 à immersion à l’huile. La calcéine est excitée à 488 nm et émet à 515 nm alors que le DilC18(3) est excité à 543 nm et émet à 565

nm. Si les cellules ont établi une communication cellulaire, la calcéine sera transmise de la cellule donneuse aux cellules receveuses.

Pour étudier la communication hétérocellulaire, les cellules cancéreuses prostatiques sont les cellules donneuses qui ont été déposées sur les ostéoblastes. Quatre jours avant le dépôt des cellules cancéreuses prostatiques, les ostéoblastes ont été ensemencés à 2,5.104

Photoblanchiment

K

Communication intercellulaire

Pas de communication intercellulaire

e

_{= (F}

-F

)/(F

-F

)

kt = -ln(F

-F

)/(F

-F

)

k= constante de perméabilité relative exprimée en min-1 Fi= intensité de la fluorescence initiale

Ft= intensité de la fluorescence au temps t F0= intensité de fluorescence au temps t=0.

A

B C

Figure 32 : Principe de la méthode du gap-FRAP.

Les cellules cancéreuses prostatiques sont chargées 10 min avec une sonde fluorescente hydrophobe la 6- carboxyfluorescéine diacétate. Les estérases intracellulaires vont cliver la partie hydrophobe la piégeant ainsi dans les cellules. Grâce au photoblanchiment d’une cellule par un flash lumineux, il sera possible de visualiser le retour de fluorescence (A) à travers les jonctions communicantes. De plus, ce retour suit une constante de temps exponentielle indiquée en (B). Le niveau de fluorescence peut être quantifié d’une part en terme de pourcentage de cellules couplées et d’autre part en calculant une constante de perméabilité relative. Une linéarisation de l’équation précédente (C) permet d’obtenir cette constante de perméabilité relative, k.

0 50 100 150 200 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 cellule contrôle

cellule photoblanchie communicante cellule photoblanchie non communicante

Temps en secondes F lu ores cen ce n orm al is ée ( % du pr eb le ac h)

2. La technique du Gap-FRAP : Fluorescence Recovery After Photobleaching (méthode quantitative).

La fonctionnalité de la communication jonctionnelle peut être également évaluée par l’étude de la cinétique du retour de fluorescence d’une cellule fluorescente vers une cellule photoblanchie (Wade et al., 1986). Le photoblanchiment correspond à la perte totale de fluorescence d’un fluorochrome suite à une exposition lumineuse de forte intensité. Si la cellule photoblanchie est connectée aux cellules adjacentes par l’intermédiaire des jonctions communicantes, un retour exponentiel de la fluorescence en provenance de ces cellules va pouvoir être observé (Figure 32A). Ce retour de fluorescence peut être effectué par des ponts cytoplasmiques et les canaux jonctionnels. Afin de distinguer les deux retours, une constante de perméabilité relative est définie et les constantes mesurées pour les ponts cytoplasmiques atteignent généralement des valeurs supérieures ou égales à 2. De plus, le retour de fluorescence effectué par les canaux jonctionnels est bloqué par l’utilisation de bloqueurs de la communication.

Les cellules cancéreuses prostatiques ont été ensemencées dans une boîte de Pétri de 35 mm de diamètre sur lamelles de verre. A 70% de confluence, les cellules ont été rincées avec du Tyrode puis incubées pendant 10 min à température ambiante avec du Tyrode contenant la forme lipophile de la sonde fluorescente correspondant à 6-carboxyfluorescéine diacétate à 7 μg/mL (Sigma) dans 0,25% de DMSO. Cette sonde est excitée à 488 nm et émet à 530 nm. Après plusieurs rinçages pour éliminer l’excédent de sondes, les cellules chargées ont été observées en microcopie confocale (FV 1000 Olympus IX-81, Tokyo, Japon) sur un support maintenu à 37°C. Une cellule a été sélectionnée puis photoblanchie en appliquant une stimulation Laser de forte intensité à l’aide d’un Laser à 405 nm. Le niveau de fluorescence émit à 530 nm a été enregistré toutes les 15 sec pendant 5 min. Le niveau de fluorescence non photoblanchie a été également enregistré (cellule contrôle) afin d’estimer et de normaliser la perte de fluorescence lié à l’enregistrement (Figure 32B). Quand les cellules photoblanchies sont connectées avec les cellules adjacentes, il est possible de mesurer une constante k de perméabilité relative à partir de la courbe de retour de fluorescence et de l’équation suivante : (Fi-Ft)/(Fi-F0)=e-kt où Fi, Ft et F0 correspondent aux intensités de fluorescence mesurées respectivement avant le photoblanchiment, au temps t et t=0 juste après le photoblanchiment

Matériels et Méthodes.

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