Méthodes échographiques pour la caractérisation de matériaux
4. Rhéoacoustique à ondes longitudinales pour l’étude des propriétés des muscles : myopathie de Duchenne
4.1. Contexte et objectifs de l’étude.
Dans les paragraphes précédents, les méthodes échographiques que j’ai présentées ont permis d’évaluer des paramètres rhéologiques clairement identifiés en mode longitudinal ou transverse. En ce qui concerne les études portant sur les muscles, le problème devient très complexe pour une raison assez simple : les ondes transverses hautes fréquences qui permettraient d’avoir des informations pertinentes sur G’ et G’’ ou sur la viscosité et de la résolution spatiale ne se propagent pas ou très mal dans les muscles et les ondes longitudinales qui elles se propagent manquent de sensibilité aux pathologies. Les méthodes modernes comme l’élastographie qui elles utilisent des ondes longitudinales hautes fréquences et des ondes transverses basses fréquences permettent d’évaluer les constantes élastiques des muscles mais aujourd’hui ne permettent pas de travailler sur de petits échantillons. Par ailleurs les élastographes sont très coûteux. Pour ces raisons nous avons donc mis au point une approche expérimentale spécifique, les approches classiques ne permettant pas de fournir de réponse.
Contrairement aux paragraphes précédents, dans les thèses de A. Leydier [LEYD-08] et H. Blasco [BLAS-10] sur ce sujet, nous n’avons pas essayé d’évaluer les modules élastiques, l’objectif étant plutôt de trouver un traceur ultrasonore de la pathologie. La pathologie musculaire se traduisant par une modification structurale du muscle (adipose, fibrose), nous avons concentré notre attention sur l’atténuation longitudinale qui est sensible au hétérogénéités [LIN-88][TERV-85] car elles peuvent diffuser énormément l’onde ultrasonore si la fréquence est bien choisie.
Partie 2: méthodes échographiques pour la caractérisation de matériaux viscoélastiques.
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4.2. Eléments concernant la myopathie de Duchenne.
La myopathie de Duchenne est causée par l’absence de dystrophine, une protéine qui joue un rôle fondamental d’un point de vue mécanique en assurant l’intégrité des membranes musculaires. Une des conséquences majeures d’un déficit en dystrophine est la dégénérescence des fibres musculaires et une perte progressive de la force musculaire. Diverses modifications structurales du muscle, visibles optiquement de cette atteinte sont : l’invasion graisseuse, l’apparition de fibrose, la modification de l’allure des cellules, la perte de régénération cellulaire [LYNC-07][KOEN-98]. L'objectif de cette étude est de trouver un paramètre ultrasonore capable de donner des informations pertinentes liées à la microstructure du muscle malade. Cette étude "in vitro" porte sur la souris MdX, modèle animal de la myopathie de Duchenne. Pour les souris Mdx, tous les muscles squelettiques sont affectés par une nécrose. Cette dégénérescence commence quinze jours après la naissance, mais seulement le muscle du diaphragme a une évolution qui est comparable à l'évolution observée dans la myopathie humaine [FAUL-08][GROU-08][STRA-97]. (Figures 17a et b).
Figure 17a : structure d’un diaphragme de souris saine (BL10).
Figure 17b : structure d’un diaphragme de souris MdX : invasion graisseuse, fibreuse, et dégénérescence des cellules.
Même si les symptômes observés chez les souris sont atténuées par rapport à la myopathie humaine, cet animal constitue un excellent modèle. Par conséquent, le diaphragme MdX (petit échantillon : voir figure 18) a été choisi pour la présente étude.
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4.3. Echantillons et protocole de mesure [LAUX-10][LEYD-08].
Les souris saines utilisées comme témoins sont des souris sauvages classées (C57BL/10). Les souris déficientes en dystrophine sont des souris classées MdX. Ces souris proviennent du laboratoire Jackson (Bar Harbor, ME, USA) et sont sélectionnées dans les tranches d’âge suivantes : 3, 10, 12, 18 mois. L’étude a été approuvée par le comité institutionnel de soin animal universitaire (numéro d’agrément 1 34-545). En pratique, les diaphragmes sont disséqués immédiatement après la mort de l’animal et divisés en 2 parties suivant le protocole standard de dissection. La dissection a été effectuée quelques minutes avant la mesure ultrasonore ce qui a permis l’étude de tissus frais ayant conservé leurs propriétés viscoélastiques. Une fois la mesure ultrasonore effectuée en quelques minutes, les échantillons ont été cryogénisés à l’azote liquide et transportés au CHRU Arnauld de Villeneuve dans l’unité « physiologie et médecine expérimentale du cœur et des muscles » (UMR INSERM 1046) dirigée par le Professeur Jacques Mercier pour analyse histomorphologique : après réalisation de fines lamelles de diaphragme à l’aide d’un microtome, une analyse d’image (logiciel HistoLab) a été effectuée pour estimer le pourcentage de zone musculaire et graisseuse.
Figure 18. Prélèvement du diaphragme.
4.4. Approche ultrasonore.
Pour mesurer l’atténuation ultrasonore, le protocole de mesure est le même que celui utilisé pour les liquides. L’idée est de comprimer légèrement le diaphragme avec un transducteur ultrasonore et d’analyser le signal qui effectue le parcours suivant : propagation aller dans le diaphragme, réflexion sur un support rigide, propagation retour dans le diaphragme. Si le diaphragme est comprimé pas à pas, son épaisseur est peu à peu réduite. Le temps de parcours du signal est réduit peu à peu. Comme pour les liquides, ceci permet d’évaluer la vitesse ultrasonore et l’atténuation. Cependant ici, compte tenu de la taille et de l’épaisseur du diaphragme, la réduction d’épaisseur doit être infime pour ne pas détériorer l’échantillon. Pour toutes les mesures réalisées les compressions ont conduit à une réduction d’épaisseur de l’ordre de 100 µm. Compte tenu de la faible épaisseur des diaphragmes (environ 500 µm), pour éviter l’overlapping d’échos il a été nécessaire de travailler à haute fréquence. Nous avons choisi une fréquence de 50 MHz avec une bande passante de 20 MHz, ce qui correspond dans le muscle à une longueur d’onde principale de 30 µm si l’on suppose que la vitesse longitudinale est voisine de 1600 m.s-1. Cette longueur d’onde, voisine de la taille des cellules musculaires, des amas graisseux s’infiltrant dans le muscle et de la taille des zones fibreuses induites par la maladie a permis de se mettre dans des conditions de type (diffuseur) et d’augmenter l’atténuation par diffusion. Pour s’adapter aux dimensions latérales des échantillons, la ligne à retard est un petit barreau de silice de diamètre 3 mm. Un cristal piézoélectrique d’épaisseur voisine de 40 µm déposé sur cette ligne à retard assure la génération et la réception des ultrasons (Figure 19).
Partie 2: méthodes échographiques pour la caractérisation de matériaux viscoélastiques.
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Figure 19. Description du capteur à gauche et photo du capteur usiné à droite.