Reconstitution du relai in vitro

Le modèle actuel de l’activation de Yap1 par H₂O₂ implique, de façon séquentielle,

l’oxydation du résidu C_P de Orp1 par H₂O₂, l’attaque de la Cys598 de Yap1 sur

l’intermédiaire Orp1—SOH formé, conduisant à l’espèce disulfure mixte Yap1—S—S—

Orp1, et enfin l’échange de ce pont disulfure C_P—Cys598 par l’attaque de la Cys303 de Yap1

pour former l’espèce Yap1 oxydée par un pont disulfure intramoléculaire Cys303—Cys598

(Figure 46). Des étapes ultérieures

conduisent à d’autres formes oxydées de

Yap1 possédant au moins deux ponts

disulfure entre les Cys en positions

598—303 et 629—310 (Figure 27 p. 53).

Comprendre les mécanismes à l’origine

de la spécificité de la réaction entre

Orp1—SOH et Yap1 impliquait

nécessairement d’être en mesure de

reconstituer le relai complet, avec ses

trois composants Yap1, Orp1 et Ybp1.

1. Stratégie

Le relai d’oxydation de Yap1 par H₂O₂ a donc été reconstitué in vitro en utilisant les

protéines recombinantes purifiées. Concrètement, un mélange réactionnel composé d’une

solution équimolaire des protéines Yap1 et Ybp1 est incubé avec un excès de la protéine

Orp1, la réaction étant déclenchée par l’ajout de 100 μM de H₂O₂. D’après la constante de

vitesse k_SOH (de 1,6.105 M-1.s-1, Chapitre III.A.2, p.78) cette concentration assure que la

première étape du relai (la formation de l’intermédiaire Orp1—SOH), se produit avec une

constante de vitesse de 16 s-1 non limitante par rapport aux étapes ultérieures du mécanisme

(Chapitre III.C.2, p.92). De plus, cette concentration modérée permet d’éviter les événements

d’oxydation non spécifiques, compte-tenu de l’échelle de temps utilisée inférieure à la min.

Le relai d’oxydation de Yap1 par H₂O₂ a également été étudié en absence de la protéine Ybp1

dans le but d’identifier la fonction moléculaire de ce composant. La reconstitution du relai

in vitro nousa servi de base pour suivre la réaction d’activation de Yap1 par électrophorèse

de type SDS-PAGE (Chapitre III.B.2, p.83) et par une approche de cinétique rapide.

Figure 46. Modèle actuel du relai H2O2/Orp1/Yap1.

(d’après D’Autreaux et Toledano, 2007 (312))

Dans ce relai, deux résidus Cys peuvent interférer avec la formation de

l’intermédiaire Yap1—S—S—Orp1 : le résidu C_R de Orp1 (Cys82) et la Cys303 de Yap1

(Figure 46, p.82). Nous avons donc utilisé, en plus des protéines sauvages, des mutants de ces

résidus notés Orp1CCS (mutation de la C_R C82S) et Yap1SCC CCC (mutation C303S). Afin

d’éviter des réactions secondaires non spécifiques, des mutations des autres Cys de ces deux

protéines ont été ajoutées en combinaison à ces variants, les mutants sont notés Orp1CSA

(mutations C64S, à noter que le résidu Cys64 n’intervient pas dans la catalyse de Orp1, et

C82A) et Yap1SSS CSS (mutations des résidus des domaines n- et c-CRD de Yap1 à l’exception

de la Cys598 : mutations C303S, C310S, C315S, C620S et C629S).

2. Analyse par électrophorèse de type SDS-PAGE : premier indice

sur le rôle de Ybp1

La formation des produits de la réaction a été suivie en absence de réducteur par

électrophorèse en conditions dénaturantes sur gel de polyacrylamide SDS-PAGE. Pour cela,

les réactions ont été stoppées après une minute d’incubation avec H₂O₂ par dénaturation

(en présence de SDS) et blocage des résidus Cys libres par alkylation (par ajout de N-éthyl

maléimide (NEM)). Les gels présentés Figure 47 (p.85), révélés au bleu de Coomassie,

permettent d’observer les protéines de poids moléculaire supérieur à 50 kDa, le monomère de

Orp1 (18 kDa) migrant hors du gel. Il est à noter que les protéines Yap1 et Ybp1 migrent de

manière inversée par rapport à l’ordre attendu d’après leurs poids moléculaires, Ybp1

(80 kDa) migrant légèrement plus rapidement que Yap1 (75 kDa).

En présence des protéines Yap1 sauvage et Orp1 sauvage (Figure 47 A, p.85),

l’addition de H₂O₂ induit la formation de deux bandes supplémentaires, l’une légèrement plus

mobile électrophorétiquement que Yap1 sauvage et l’autre migrant plus lentement. La nature

de ces bandes, validées par spectrométrie de masse MS/MS après digestion trypsique,

correspond à une forme oxydée de Yap1 et à un complexe covalent Yap1—Orp1,

respectivement (données non montrées). Par comparaison à des études précédentes réalisées

in vitro et in vivo (231,276,331), ces bandes peuvent être attribuées respectivement à une

espèce Yap1 oxydée par la formation de pont(s) disulfure intramoléculaire(s) avec au moins

un pont disulfure entre les Cys303 et Cys598 (notée Yap1_OX) et à l’espèce disulfure mixte

impliquant la C_P de Orp1 et la Cys598 de Yap1 (noté Yap1—S—S—Orp1 d’une masse

moléculaire de 93 kDa). De façon attendue, l’espèce Yap1_OX n’est pas observée pour le

mutant de Yap1 présentant seulement la mutation Cys303Ser (mutant Yap1SCC CCC,

Figure 47 B, E, H, p.85), confirmant que le pont disulfure intramoléculaire Cys303—Cys598

est le premier à être formé dans la séquence d’activation de Yap1 par H₂O₂. En l’absence de la

Cys303, l’intermédiaire Yap1—S—S—Orp1 peut donc s’accumuler (mutant Yap1SCC CCC,

Figure 47 B, E, H et mutant Yap1SSS CSS, Figure 47 C, F, I, p.85).

Dans toutes les expériences où Orp1 sauvage a été utilisé, l’intermédiaire

Yap1—S—S—Orp1 n’est observé qu’en présence du partenaire Ybp1 (Figure 47 A, B et C,

p.85). Par contre, dans toutes les expériences mettant en jeu un mutant de Orp1 dans lequel la

C_R a été substituée (mutants Orp1CCS et Orp1CSA), l’espèce Yap1—S—S—Orp1 est observée

en présence mais également en l’absence de Ybp1 (Figure 47 D à I, p.85). Ce résultat est

particulièrement évident pour le mutant Yap1SSS CSS pour lequel la quasi-totalité de la protéine

Yap1 réduite s’accumule sous cette forme. Ces résultats suggèrent que Ybp1 joue un rôle

critique dans la réaction entre Orp1—SOH et la Cys598 de Yap1 en présence du résidu C_R de

Orp1. Compte-tenu du fait que la constante de vitesse de la réaction intramoléculaire de la C_R

sur Orp1—SOH est très élevée (k_SS = 507 s-1, Chapitre III.A.2, p.78), il est très probable que la

C_R entre en forte compétition avec la Cys598 de Yap1. Par conséquent, une fonction

essentielle de Ybp1 pourrait être de contrôler la vitesse de l’étape de formation du pont

disuflure intramoléculaire de Orp1 (k_SS).

D’autre part, en présence des mutants de la C_R de Orp1 (Orp1CCS et Orp1CSA) et des

formes Yap1 sauvage et Yap1SCC CCC (Figure 47 D, E, G et H, p.85), l’addition de H₂O₂ produit

de nombreuses espèces de hauts poids moléculaires et conduit à la consommation de la

quasi-totalité de l’espèce Yap1 réduite. Ces espèces correspondent vraisemblablement à de

multiples adduits de Orp1 avec Yap1 ou à des multimères de Yap1, résultant de la réaction

initiale entre Orp1—SOH et les Cys de Yap1. En présence de Ybp1, une fraction limitée de

Yap1 est redirigée vers la formation des espèces Yap1_OX ou Yap1—S—S—Orp1.

La substitution des résidus Cys de Yap1, à l’exception de la Cys598, mutant Yap1SSS CSS,

abolit la formation de ces espèces et conduit à l’accumulation de près de 100% de Yap1 sous

forme Yap1—S—S—Orp1 (Figure 47 F et I, p.85).

A. B. C.

D. E. F.

G. H. I.

Figure 47. Analyse de la formation des espèces Yap1OX et Yap1—S—S—Orp1 par électrophorèse

de type SDS-PAGE en conditions non réductrices.

Les concentrations des protéines Yap1, Ybp1 et Orp1 sont fixées respectivement à 2 μM, 2μM et

10 μM. Le volume réactionnel est de 100 μL et la réaction est conduite à température ambiante dans le

tampon D. La réaction, déclenchée par H2O2 à 100 μM, évolue pendant 1 min, puis est stoppée par

addition de SDS 5%, NEM 50 mM suivie d’une incubation à 30°C pendant 1h. Après séparation par

électrophorèse en conditions dénaturantes de type SDS-PAGE (gel 10% acrylamide/bisacrylamide

30/0,44), les protéines sont colorées spécifiquement par coloration colloïdale au bleu de Coomassie

(295). Les espèces Yap1OX et Yap1—S—S—Orp1 ont été vérifiées par spectrométrie de masse

MS/MS. L’astérisque rouge (*) correspond à un contaminant associé à la protéine Yap1SCC CCC

. Les

triangles rouges, bleus, noirs et oranges indiquent respectivement l’espèce Orp1—S—S—Yap1 et les

protéines Yap1 réduite, Yap1OX et Ybp1.

Dans le document Les peroxydases à thiol, relais dans la signalisation cellulaire redox associée au peroxyde d’hydrogène : mécanismes moléculaires responsables de la spécificité de l’activation du facteur de transcription Yap1 chez Saccharomyces cerevisiae (Page 120-124)