Caractérisation biochimique des protéines recombinantes

recombinantes

Le coefficient d’exctinction molaire à 280 nm des protéines recombinantes a été

déterminé par la méthode de Lewis (346). Cette méthode repose sur le calcul de la

concentration en protéine par une relation empirique (Équation 24).

(DO₂₈₀-10(2,5*LogDO320 - 1,5*LogDO350))/

(5’540*nombre de Trp par monomère + 1'480*nombre de Tyr par monomère)

Équation 24

La valeur du coefficient d’extinction molaire est ensuite déduite par la relation de

Beer Lambert.

2. Dosage des groupements thiols libres par le 5,5’-dithiobis(2-nitro)benzoate

Le contenu en thiol libre (—SH) des protéines recombinantes a été déterminé par

réaction avec le 5,5’-dithiobis (2-nitro) benzoate (DTNB) à 0,3 mM en suivant l’apparition du

thionitrobenzoate libéré à 412 nm (ε₄₁₂ = 13’600 M-1.s-1) (Figure 65). La concentration en

protéine (7,35 μM) est choisie pour donner un signal de 0,1 DO à 412 nm par fonction thiol

libre. En conditions dénaturantes (Urée 1 M final), l’expérience permet de doser la totalité des

résidus Cys sous forme réduite. Le tampon utilisé pour le dosage est le tampon C.

Figure 65. Dosage des groupements thiols libres par le DTNB.

Le contenu en thiol libres des protéines est déterminé par réaction avec le DTNB en suivant par

spectrophotométrie à 412 nm l’apparition du thionitrobenzoate libéré (ɛ₄₁₂ = 13'600 M-1

.cm-1

).

-

3.Évaluation du rayon hydrodynamique et de la polydispersité des solutions

protéiques

La diffusion dynamique de la lumière (DLS) est une technique non invasive de

mesure du rayon hydrodynamique et de la polydispersité de molécules en solution. Cette

technique permet d’appréhender le comportement d’une protéine, solubilité contre agrégation,

dans une solution tampon donnée. Les mesures ont été réalisées à l’aide d’un appareil

Zetasizer Nano S (Malvern). Un crible de solution tampon à 12 conditions intégrant

4 conditions de force ionique (NaCl 0 ; 0,2 ; 0,5 ou 1 M) et 3 conditions de pH (tampon

Na₂HPO₄ 20 mM pH 7, 8 ou 9) a été testé. Les mesures sont réalisées sur un volume de 15 μL

de solution protéique à une concentration de 1 mg/mL. Les échantillons sont centrifugés 1h à

4°C à 12000 g avant la mesure.

4.Évaluation du contenu en structures secondaires des protéines recombinantes

Le dichroïsme circulaire est une technique qui permet d’analyser la structure

secondaire des macromolécules, et notamment des protéines, en solution. Des spectres de

dichroïsme circulaire ont été réalisés sur les protéines recombinantes purifiées, sauvage et

mutées (Yap1 et Orp1) afin de vérifier que la présence de ces mutations n’affectait pas le

contenu en structures secondaires de la protéine considérée. Les mesures ont été enregistrées

à l’aide d’un appareil Chirascan-plus (Applied photophysics) de 180 à 260 nm (UV lointain)

avec un pas de 0,5 nm et une température de 25°C. La cuve utilisée est une cuve en quartz

présentant un trajet optique de 0,1 mm et le tampon de mesure est le tampon E. La mesure du

spectre du tampon est soustraite aux valeurs des données des échantillons. Trois spectres sont

effectués pour chaque mesure et sont moyennés pour augmenter le rapport signal/bruit.

Les spectres de dichroïsme circulaire des protéines sauvages et mutées (protéines

Orp1 et Yap1) sont quasiment superposables, indiquant que les mutants Orp1CSA, Orp1CCS,

Yap1SCC CCC, Yap1SSS CSS et Yap1SSS SSS présentent un repliement identique à leur équivalent

sauvage (Figure 66, p.129).

5.Détermination de la masse moléculaire des protéines recombinantes par

spectrométrie de masse

La spectrométrie de masse est une technique qui nécessite l’utilisation d’un

échantillon ne présentant aucune trace de sels non volatils. Les protéines recombinantes ont

été dessalées par chromatographie en phase inverse sur une colonne de type C8 (Vydac

208TP54, 4,6x250 mm 300 Å et 5 μm, Grace) couplée au système HPLC Äkta explorer

(Amersham Biosciences). Les protéines ont été éluées par un gradient de 0 à 80%

d’acétonitrile additionné de TFA 0,1% en 10 volumes colonne, et la fraction la plus

concentrée a été directement analysée à l’aide d’un spectromètre de masse de type

électrospray (MicrOTOF-Q Bruker Daltonics) en conditions dénaturantes afin de déterminer

les masses moléculaires des protéines sauvage et mutées. Les analyses ont été réalisées par H.

Mazon au sein du service commun de spectrométrie de masse et des techniques

chromatographiques couplées de l’UMR 7565 CNRS UL, Institut Jean Barriol.

L’identification de bandes d’intérêt, obtenues après séparation de mélanges

complexes sur gel de polyacrylamide de type SDS-PAGE, a été réalisée par spectrométrie de

masse de type MS/MS à l’aide d’un spectromètre de masse MALDI TOF/TOF à haute

fréquence (Bruker). L’identification des espèces d’intérêt a été réalisée par J.-B. Vincourt au

sein de la plateforme de protéomique du Biopole (UMR 7365 CNRS Université de Lorraine).

6. Spectres de fluorescence de Orp1 réduite et oxydée

Les spectres d’excitation et d’émission de fluorescence de la protéine Orp1 sauvage

sous forme réduite et oxydée disulfure ont été réalisés à l’aide d’un spectrofluorimètre

SAFAS Flx-Xenius à une concentration en enzyme de 10 μM dans le tampon D. Les spectres

d’émission sont obtenus pour une longueur d’onde d’excitation fixe de 282 nm et une

Figure 66. Spectres de dichroïsme circulaire des formes sauvage et mutantes des protéines Orp1

et Yap1.

Les mesures ont été enregistrées à l’aide d’un appareil Chirascan-plus (Applied photophysics) de 180 à

260 nm avec un pas de 0,5 nm et à une température de 25°C. Les concentrations en protéines sont

respectivement de 20 μM et 50 μM pour les protéines Yap1 et Orp1. La cuve utilisée est une cuve en

quartz présentant un trajet optique de 0,1 mm et le tampon de mesure est le tampon E. La mesure du

spectre du tampon est soustraite aux valeurs des données des échantillons. Trois spectres sont effectués

pour chaque mesure et sont moyennés pour augmenter le rapport signal/bruit.

Spectres dichroïques des protéines Yap1 (A) et Orp1 (B) sauvage et mutées.

B.

longueur d’onde d’émission variant de 300 à 500 nm par incrément de 1 nm.

Le photomultiplicateur est réglé à 500 V.

V. Électrophorèse de type SDS-PAGE en conditions non réductrices et

Dans le document Les peroxydases à thiol, relais dans la signalisation cellulaire redox associée au peroxyde d’hydrogène : mécanismes moléculaires responsables de la spécificité de l’activation du facteur de transcription Yap1 chez Saccharomyces cerevisiae (Page 169-172)