Chez les levures

L’un des régulateurs clefs de la réponse au stress oxydant chez les levures est la

classe AP-1 de facteur de transcription à domaine bZip (Basic domain – Leucine Zipper).

Le membre de cette classe qui a été le plus caractérisé est le facteur de transcription AP-1 de

S. cerevisiae (Yap1). Des homologues de Yap1 ont été identifiés dans un certain nombre

d’autres espèces de levure (279) avec en particulier Pap1 de S. Pombe et Cap1 de C. Albicans

qui ont été caractérisés plus récemment (280–282). La régulation de ces protéines est assurée

Figure 23. Mécanismes proposés de l’activation d’une protéine de régulation par H2O2 via un

senseur de type peroxydase à thiol.

Capteur : peroxydase à thiol, cible : protéine de régulation, SOx : Cys oxydée (Adapté de Sobotta et

al., 2014 et Winterbourn et Hampton, 2014 (278)).

intramoléculaire(s) dissimulant un signal d’export nucléaire en condition de stress.

Cette caractéristique reflète la conservation du domaine bZip, de deux domaines riches en Cys

N- et C-terminal et de domaines d’import et d’export nucléaire. L’activation des facteurs de

transcriptions Yap1, Pap1 et Cap1 est indirecte et fait intervenir une peroxydase à thiol en tant

que détecteur de H₂O₂ selon un mécanisme qui est similaire pour Yap1 et Cap1 (282)

et différent pour Yap1 et Pap1. Il n’est pas connu si ces mécanismes sont conservés dans

d’autres espèces levures.

a.Le relai Tpx1/Pap1 de Schizosaccharomyces pombe

Pap1 (pombe AP-1) est un facteur de transcription possédant un domaine de liaison à

l’ADN de type bZip, homologue aux facteurs AP-1 de mammifère (c-Jun, c-Fos, etc).

Son activation est critique pour la réponse adaptative de S. pombe au stress oxydant (283).

En réponse à H₂O₂, Pap1 induit l’expression de 40 à 80 gènes impliqués dans la défense

antioxydante (ntr1, catalase1, etc) et la résistance à différents composés chimiques (283–286).

Pap1 présente une organisation en plusieurs domaines fonctionnels (Figure 24 A) :

un domaine NLS (Nuclear Localisation Signal) reconnu par une importine ; un domaine

Leucine-zipper de liaison à l’ADN, deux domaines CRD (Cys Rich Domain) qui contiennent

chacun quatre et trois résidus Cys (Cys259, Cys278, Cys285 et Cys290 pour le n-CRD et

Cys501, Cys523 et Cys532 pour le c-CRD) et un domaine NES (Nuclear Export Signal)

Figure 24. Régulation redox de la localisation nucléaire de Pap1.

NLS : domaine d’import nucléaire, bZip : domaine Leucine-Zipper, NES : domaine d’export nucléaire,

n- et c- CRD : domaines riches en Cys N- et C-terminal. Les résidus Cys sont représentés par des traits

jaunes.

A. Pap1 possède un domaine NLS, reconnu par une importine, ainsi qu’un domaine NES, reconnu par

l’exportine Crm1. Dans des conditions basales, Pap1 est importé dans le noyau et exporté avec une

localisation majoritairement cytoplasmique. B. En condition de stress induit par H2O2, Pap1 s’oxyde par

la formation de pont(s) disulfure(s) intramoléculaire(s) impliquant les Cys des deux CRD (représenté(s)

en rouge). Cet événement est responsable d’une modification de la conformation du facteur de

transcription. L’exportine Crm1 ne peut alors plus reconnaître le domaine NES de Pap1 et le facteur de

transcription s’accumule alors dans le noyau où il induit l’expression de ses gènes cibles (adapté selon

Boronat et al., 2014 (289)).

NLS bZip

n-CRD

c-CRD

Crm1

NLS bZip

n-CRD

c-CRD

Importine

Importine

NES

A.

B.

reconnu par l’exportine Crm1 (« Chromosomal Maintenance 1 », aussi connue sous le nom de

exportine 1) (288). Dans cette organisation, le domaine NES est superposé au domaine

c-CRD.

La régulation de Pap1 dépend de sa localisation sub-cellulaire. En l’absence de

stress, Pap1 est présent sous forme réduite. Les signaux NES et NLS sont respectivement

accessibles à l’exportine et à l’importine (Figure 24 A, p.49). Pap1 est alors échangé entre les

compartiments cytoplasmique et nucléaire, avec une localisation globalement cytoplasmique.

En condition de stress induit par H₂O₂, Pap1 s’oxyde par formation d’au moins un pont

disulfure intramoléculaire entre les domaines CRD (n-CRD et c-CRD), conduisant à un

changement de conformation de la protéine (Figure 24 B, p.49) (290–292). Ce changement de

conformation a pour conséquence de dissimuler le domaine NES de Pap1 qui ne peut alors

plus interagir avec l’exportine Crm1 : Pap1 s’accumule dans le noyau et induit l’expression de

ses gènes cibles (290,291). Il a été démontré que les résidus Cys278, Cys285 et Cys523 sont

essentiels pour l’activité du facteur de transcription, alors que la Cys501 n’est pas

indispensable, mais nécessaire pour son activation totale (292).

L’oxydation de Pap1 par H₂O₂ est indirecte. Elle dépend à la fois de la peroxydase à

thiol Tpx1 (Thioredoxin Peroxidase 1), et de la Trx1 (la Trx cytoplasmique majeure de

S. pombe) (280,281) (Figure 25, p.51). Tpx1 est l’unique 2-Cys Prx typique de S. pombe et est

essentielle pour la dégradation des peroxydes pendant la croissance aérobie normale

(293,294). Il a été prouvé que les deux résidus Cys de Tpx1, C_P et C_R, sont requis au cours de

l’activation de Pap1. Le modèle proposé postule que l’activation de Pap1 soit relayée

directement par Tpx1 en tant que détecteur d’H₂O₂ par un mécanisme d’échange de ponts

disulfure mais n’explique pas le rôle de la Trx1 dans ce relai redox (267,268, 270) (Figure 25,

p.51). À des concentrations élevées de H₂O₂ (> 0,2 mM) Tpx1 se suroxyde par formation d’un

acide sulfinique C_P—SO₂H, rendant l’enzyme temporairement inactive. À ces concentrations

de H₂O₂ (295), la voie de réponse générale au stress MAPK contrôlée par Sty1 (aussi connu

sous le nom de Spc1) est activée (274, pour revue). Cette voie aboutit à l’activation du facteur

de transcription Atf1 (297,298) induisant l’expression de plus de 200 gènes dont plusieurs ont

un rôle dans la protection contre le stress oxydant (299,300), parmi lesquels srx1, rendant

possible la réduction de Tpx1 suroxydée (280,281).

Pap1 peut également être activé par plusieurs autres espèces chimiques réactives

envers les thiols via un mécanisme indépendant de Tpx1 qui impliquerait la modification

b.Le relai Orp1/Yap1 de Saccharomyces cerevisiae

Le facteur de transcription Yap1 est l’orthologue et l’équivalent fonctionnel et

structural de Pap1 chez la levure S. Cerevisiae. Cependant, la réponse antioxydante induite

par Yap1 est dépendante d’un système à trois composants impliquant Orp1, une CysGpx et

Ybp1, une protéine dont la fonction était inconnue lorsque j’ai débuté mon projet de thèse.

i.Le facteur de transcription Yap1

Yap1 (Yeast AP-1) est activé par oxydation lorsque le niveau de H₂O₂ du cytoplasme

augmente au dessus d’un certain seuil (301,302). Ce facteur de transcription induit alors

l’expression de gènes codant pour la plupart pour des protéines antioxydantes et des

composants des voies cellulaires de réduction des thiols (121,302–304). Yap1 présente la

même organisation en domaines que Pap1, à l’exception du domaine n-CRD qui possède

seulement trois résidus Cys (283,264) (254, pour revue). On retrouve dans le n-CRD les

résidus Cys303, Cys310 et Cys315, et dans le c-CRD les résidus Cys598, Cys620 et Cys629.

L’activation de Yap1 est dépendante de sa localisation sub-cellulaire selon un mécanisme

Figure 25. Modèle du relai H2O2/Tpx1/Pap1.

Le mécanisme d’activation de Pap1 commence par la réaction entre la CP (Cys48) de Tpx1 et H2O2

pour former un acide sulfénique, qui sera attaqué par la CR (Cys169) de l’autre monomère de Tpx1,

pour former un pont disulfure. Celui-ci est ensuite échangé en un pont disulfure intermoléculaire avec

Pap1 par attaque de l’une des Cys essentielles d’un des deux CRD du facteur de transcription. Ce pont

disulfure est ensuite échangé en un pont disulfure intramoléculaire par l’attaque d’une Cys essentielle

de l’autre CRD de Pap1, cet événement conduisant à la libération de l’homodimère de Tpx1. La

formation d’un second pont disulfure entre les CRD de Pap1 pourrait avoir lieu selon un mécanisme

similaire par le recrutement d’un autre homodimère de Tpx1 oxydé par au moins un pont disulfure

intermoléculaire. Le rôle de la Trx1 dans ce modèle n’est pas décrit (adapté selon Boronat et al., 2014

(289)).

identique au facteur de transcription Pap1 (288,306) (307) (231,283,306,308) (Figure 26).

Le terminateur de cette voie de signalisation est également la Trx (231).

Il a été démontré que seuls les résidus Cys303 et Cys598 sont indispensables pour

l’activation oxydative de Yap1 (231). Les autres résidus Cys des CRD pourraient néanmoins

former deux autres ponts disulfure (Cys310—Cys629 et Cys315—Cys620) qui ont été

impliqués dans le contrôle du niveau et de la durée d’activation du facteur de transcription

(309).

ii. La peroxydase à thiol Orp1 : capteur et relai

Tout comme Pap1, l’oxydation de Yap1 par H₂O₂ est indirecte. Elle fait intervenir la

peroxydase à thiol Orp1 (Oxidant Receptor Peroxidase 1, aussi connue sous le nom de Gpx3),

en tant que capteur et relai du signal redox porté par H₂O₂ (310) (Figure 27, p.53). Orp1 est

une CysGpx monomérique opérant par un mécanisme similaire aux 2-Cys Prx atypiques

(Figure 27, p.53 et 28, p.54). Il a été prouvé que la réaction d’activation de Yap1 par Orp1 fait

intervenir in vivo l’intermédiaire Orp1 oxydé sous forme acide sulfénique dans la formation

d’un pont disulfure intermoléculaire avec la Cys598 de Yap1 (276,311) et que la C_R de Orp1

Figure 26. Masquage du domaine NES de Yap1 par interaction entre les domaines n- et c-CRD.

Structure de la protéine Yap1-RD (Yap1 Redox Domain), correspondant à un domaine résistant aux

protéases de la protéine Yap1 oxydée (258) par deux ponts disulfure (Cys303—Cys598 et

Cys310—Cys629) représentés en jaune, de potentiel redox -330 mV pour le plus important, obtenue

par résonance magnétique nucléaire en solution. Ce domaine est composé des acides aminés 279 à

313 et 565 à 650. Le domaine NES (superposé au domaine c-CRD) et le domaine n-CRD sont

représentés en bleu et en cyan respectivement. Au niveau du domaine NES les résidus Ile614, Val616

et Leu623 sont d’importance modérée pour l’export nucléaire par l’exportine Crm1 alors que le résidu

Leu619 joue un rôle critique (ces résidus sont représentés en vert) (257)(259). Sous cette forme

oxydée de Yap1, les résidus Leu619 et Leu623 sont en interaction hydrophobe avec les résidus

Phe302 et Met306 (représentés en rouge) et sont par conséquent inaccessibles au solvant ainsi qu’à

l’exportine Crm1 (Adapté de Wood et al., 2004 (307)).

les études menées par l’équipe de M. Toledano ont démontré que Orp1 jouait un rôle essentiel

en tant que relai redox pour l’activation de Yap1, et non en tant que peroxydase, dans la

résistance au stress induit par H₂O₂. En effet, le mutant de la C_R de Orp1 (Cys82Ser) présente

une sensibilité identique à celle d’une souche sauvage vis à vis de H₂O₂ (276). De plus,

contrairement au relai Pap1/Tpx1 qui est inactivé à des concentrations élevées en peroxyde,

l’activation maximale du relais Orp1/Yap1 a lieu à des doses de peroxydes très élevées,

critiques pour la croissance cellulaire (231).

Figure 27. Modèle du relai H2O2/Orp1/Yap1.

Le mécanisme d’activation de Yap1 commence par la réaction entre la CP (Cys36) de Orp1 et H2O2

pour former l’intermédiaire acide sulfénique. Cet acide sulfénique réagit alors avec la Cys598 de

Yap1, située dans le c-CRD, pour former un complexe covalent Orp1—S—S—Yap1 lié par un pont

disulfure intermoléculaire Cys36—Cys598. Ce dernier est ensuite échangé en un pont disulfure

intramoléculaire Cys303—Cys598 par attaque nucléophile de la Cys303 de Yap1, située dans le

n-CRD. Cette étape s’accompagne de la libération de Orp1 sous forme réduite. La forme d’oxydation de

Yap1 présentant un pont disulfure intramoléculaire entre les résidus Cys303 et Cys598 correspond à

la forme activée du facteur de transcription. Le second pont disulfure Cys310—Cys629 se formerait

selon un mécanisme similaire par le recrutement d’une autre molécule de Orp1 seulement après la

formation du premier pont disulfure. La protéine Ybp1 est indispensable dans ces mécanismes par une

fonction qu’il reste à définir. La CysGpx Orp1 présente également un cycle catalytique caractéristique

des 2-Cys Prx atypique dans lequel la CP, oxydée sous forme acide sulfénique après la réaction avec le

peroxyde, est attaquée par la CR (Cys82) de la même chaîne polypeptidique formant un pont disulfure

intramoléculaire réduit par la Trx (265) (d’après D’Autreaux et Toledano, 2007 (312)).

Yap1 peut également être activé par plusieurs autres espèces chimiques réactives

envers les thiols et par des métaux lourds, via un mécanisme indépendant de Orp1 qui

impliquerait la modification directe des résidus Cys du domaine c-CRD (231,313).

iii. Ybp1 : facteur indispensable, fonction inconnue

La protéine Ybp1 (Yap1 Binding Protein 1) est le troisième composant indispensable

dans le mécanisme d’activation de Yap1 par H₂O₂. La représentation du gène ybp1 se limite

de manière sporadique au règne des fungis (315). En particulier, il n’est pas présent chez

S. pombe. La fonction moléculaire de la protéine Ybp1 était très peu définie lorsque j’ai

débuté mon doctorat.

Il a été prouvé par la méthode du double hybride et par la méthode TAP (Tandem

Affinity Precipitation) que la protéine Ybp1 forme un complexe non covalent avec le facteur

de transcription Yap1 sous forme réduite (316,317). Cette interaction pourrait impliquer les

résidus 379 à 650 de Yap1 (315) et les résidus 416 à 674 de Ybp1 (318), selon des résultats

obtenus par la méthode du double hybride. Des études plus récentes ont démontré que la

A. B.

Figure 28. Représentation schématique de la structure de Orp1.

Structure basée sur un modèle par homologie sur la base des structures des protéines Gpx2 et Gpx5

humaines.

A. Structure de Orp1 en représentation « ribbon ». Orp1 adopte un repliement de type Trx (un feuillet

β à 4 brins et 3 hélices α). Les résidus Cys36 (CP), Gln70 et Trp125 composant le site actif sont

représentés en « stick » (les atomes de Carbone, d’azote, d’oxygène et de soufre sont colorés

respectivement en vert, rouge, bleu et orange). La zone portant les acides aminés 69 à 86 (incluant la

CR, Cys82), modélisée par une boucle, ne présente pas une densité électronique suffisante pour être

résolue par cristallographie aux rayons X (275). Dans ce modèle, les résidus CP (Cys 36) et CR

(Cys82) sont distants de 10 Å. B. Le site actif de Orp1 est formé par des résidus conservés. Les

résidus Phe38 et Phe127 forment une face hydrophobe du site actif alors que les résidus Gln70,

Trp125 et Asn126 forment une face polaire. Les chaînes latérales des résidus Gln70 et Trp125

stabilisent, par la formation de liaison hydrogène, la forme thiolate de la CP et contribuent à la

polarisation de la liaison peroxyde du substrat. Ces résidus du site actif ont été validés

expérimentalement par mutagénèse dirigée (276). Le site actif de Orp1 ne serait pas assez volumineux

formation du complexe Yap1·Ybp1 protège Yap1 de la dégradation par les protéases, et est

donc requise pour la stabilité de Yap1 in vivo (282). De plus, il a été établi que le niveau

d’expression de Ybp1 détermine la fraction cellulaire de Yap1 répondant au stress induit par

H₂O₂ (319). L’oxydation de Yap1 par Orp1 en présence de H₂O₂ provoquerait la dissociation

de ce complexe (319).

De manière intéressante, il a été prouvé que dans la souche W303 de S. cerevisiae

(souche couramment utilisée en laboratoire) exprimant un mutant naturel de l’allèle Ybp1,

ybp1-1 qui code une protéine Ybp1 tronquée (Ybp1-1 : acides aminés 1 à 243 de Ybp1),

l’activation du facteur de transcription Yap1 n’est plus dépendante de Orp1 (315,320,321).

Dans cette souche, l’oxydation de Yap1 est dépendante de Tsa1, la 2-Cys Prx typique majeure

de cet organisme, par un mécanisme qui n’a pas encore été caractérisé mais qui comme dans

le cas de Pap1, requiert les deux C_P et C_R de Tsa1, contrairement au relai Orp1/Yap1.

Le mécanisme d’activation de Yap1 présenté Figure 27 (p.53) fait apparaître que

l’intermédiaire Orp1—SOH, espèce intrinsèquement réactive, occupe une position critique au

carrefour entre au moins deux réactions : l’une avec la C_R et l’autre avec la Cys598 de Yap1.

La réaction intramoléculaire avec la C_R étant favorisée du point de vue thermodynamique, la

question se pose des mécanismes à l’origine de la spécificité de la réaction entre Orp1—SOH

et sa cible Yap1. Cette problématique et le rôle de Ybp1 dans ces mécanismes ont constitué le

cœur de mon projet de thèse.

Mon projet de thèse s’inscrit dans la problématique générale de la signalisation

cellulaire redox impliquant le peroxyde d’hydrogène comme messager, dont un mécanisme

clef est l’oxydation de la fonction thiol du résidu Cys. In vivo, l’efficacité et la spécificité de

ce type de signalisation doivent dépendre de la coordination et donc des cinétiques relatives

de cycles d’oxydation interdépendants, impliquant des protéines cible, relai et leurs

partenaires redox cellulaires.

La voie H₂O₂/Orp1/Yap1 chez S. cerevisiae implique comme capteur et relai la

peroxydase à thiol Orp1, dont l’intermédiaire oxydé sous forme acide sulfénique Orp1—SOH

constitue un carrefour où plusieurs réactions sont potentiellement en compétition

(Figure 27, p.53) : i) avec la Cys598 de Yap1, première étape de l’activation de ce dernier ;

ii) avec la C_R de Orp1, une réaction qui doit être favorable car intramoléculaire ; iii) avec

d’autres thiols cellulaires ; iv) ou encore avec une seconde molécule de H₂O₂ qui conduirait à

la suroxydation de Orp1 sous forme acide sulfinique.

L’étude des mécanismes à l’origine de la spécificité de la réaction entre Orp1 et

Yap1 constitue la question centrale de ma thèse. Notre modèle de travail s’est appuyé sur

plusieurs hypothèses : la formation d’un complexe protéique permettant d’associer Orp1 et

Yap1; la modulation des cinétiques relatives des réactions en compétition ; l’implication du

partenaire Ybp1 dans ces mécanismes, une protéine indispensable à l’activation redox de

Yap1, mais dont la fonction moléculaire était inconnue au début de mon doctorat.

Mon travail, dont la stratégie est résumée Figure 29 (p.58), s’est donc articulé autour

de 4 axes impliquant la reconstitution in vitro du relai avec des protéines recombinantes :

I. La caractérisation des interactions protéiques entre Yap1, Ybp1 et Orp1, par des approches

biophysico-chimiques comme la microcalorimétrie de titration isotherme (ITC)

et l’anisotropie de fluorescence ;

II. La caractérisation cinétique du cycle peroxydase de Orp1, un pré-requis pour l’analyse de

la compétition entre le cycle peroxydase, la réaction avec Yap1 et une éventuelle étape de

suroxydation. Cette étude a impliqué l’utilisation d’une technique de cinétique rapide de type

« stopped flow » ;

III. La caractérisation cinétique de la réaction entre Orp1 et Yap1, et de l’impact du partenaire

Ybp1 sur ces cinétiques, qui a nécessité la mise au point d’une méthode utilisant une autre

technique de cinétique rapide de type « quenched flow » combinée à l’analyse des produits de

la réaction par spectrométrie de masse ;

IV. La caractérisation de l’influence de Yap1 et Ybp1 sur le cycle peroxydase de Orp1,

également par une approche de type « quenched flow ».

Chapitre I. Production, purification et caractérisation

des protéines recombinantes Yap1, Ybp1 et Orp1

Dans le document Les peroxydases à thiol, relais dans la signalisation cellulaire redox associée au peroxyde d’hydrogène : mécanismes moléculaires responsables de la spécificité de l’activation du facteur de transcription Yap1 chez Saccharomyces cerevisiae (Page 82-97)