Étude des interactions entre la protéine Orp1 et les protéines Yap1, Ybp1 et le

Nous avons ensuite étudié les interactions non covalentes entre la protéine Orp1

sauvage, sous forme réduite et oxydée sous forme pont disulfure (notée Orp1_SS), et les

protéines Ybp1, Yap1 sauvage et le complexe Yap1·Ybp1. Pour cela, dans un premier temps

nous avons utilisé la technique d’anisotropie de fluorescence dans les mêmes conditions que

celles décrites précédemment, en utilisant la protéine Orp1 marquée par la sonde fluorescente

Alexa Fluor® 488 5-SDP Ester (Life technologies) à son extrémité N-terminale (Orp1—AF).

La titration de Orp1—AF sous forme réduite avec Ybp1 a révélé une constante

d’affinité K_D de 42,5 ± 3,5 μM, soit une affinité relativement faible par rapport à celle obtenue

pour l’interaction entre les protéines Yap1 et Ybp1 (Figure 37, p.72).

Afin de vérifier que la fixation du fluorophore sur Orp1 n’affectait pas l’interaction

de Orp1—AF avec Ybp1, la même expérience de titration a été réalisée en présence de

Ybp1—AF et de Orp1 sous forme réduite. Cette titration « miroir » produit une augmentation

de l’anisotropie de fluorescence de moins de 1%. Ce résultat peut être expliqué par le faible

poids moléculaire de la protéine Orp1 (19 kDa) par rapport à celui de la protéine Ybp1 (80

kDa) : la formation du complexe ne permettrait pas de polariser suffisamment la fluorescence

émise par la protéine Ybp1—AF (principe de l’anisotropie de fluorescence, Figure 33, p.66).

L’affinité obtenue avec Orp1—AF n’a donc pas pu être validée par une expérience de titration

« miroir » comme pour l’interaction entre Yap1 et Ybp1.

Par conséquent, l’interaction entre les protéines Ybp1 et Orp1 a été étudiée par ITC.

L’emploi de cette technique a été rendu possible grâce à l’acquisition d’un appareil ITC 200

(GE Healthcare) par le service commun de biophysicochimie des interactions

macromoléculaires (SCBIM) de l’Université de Lorraine. En effet, cet appareil consomme

peu de matériel biologique grâce à une cellule de mesure de 200 μL.

Une solution de Ybp1 a d’abord été titrée par une solution de Orp1 sous forme

réduite. Les données expérimentales ont été ajustées à un modèle de site de liaison unique.

Contrairement au résultat obtenu par anisotropie de fluorescence, cette titration révèle une

constante d’affinité K_D de 0,8 ± 0,1 μM et une stoechiométrie de 0,8 ± 0,1 (Figure 38 A, p.73,

données et profil en noir). Cette affinité, meilleure que celle déterminée par anisotropie de

fluorescence (K_D de 42,5 ± 3,5 μM), signifie que la présence du fluorophore à l’extrémité

N-terminale de Orp1 affecte l’interaction entre Orp1 et Ybp1, invalidant l’expérience

d’anisotropie (Figure 37). Les autres interactions ont donc été étudiées par ITC. Pour éviter la

formation de ponts disulfure entre les protéines Orp1 et Yap1 sauvage pendant l’expérience,

le mutant Yap1SSS SSS a été utilisé. Nous avons démontré précédemment que l’utilisation de ce

mutant n’avait aucune conséquence sur l’interaction entre Yap1 et Ybp1 (Figure 34 B, p.68).

Aucun signal calorimétrique significatif n’a été observé pour la titration de

Yap1SSS SSS avec Orp1 sous forme réduite, suggérant que Orp1 et Yap1 n’interagissent pas

Figure 37. Suivi de l’interaction entre les protéines Orp1—AF et Ybp1 par anisotropie de

fluorescence.

L’anisotropie de fluorescence a été mesurée sur un spectrofluorimètre SAFAS Xenius XC. La

longueur d’onde d’excitation est fixée à 494 nm et l’émission de fluorescence est collectée à 523 nm.

Le mélange réactionnel est composé de 100 nM de Orp1—AF et de concentration variable de

partenaire non marqué dans le tampon D. Les données expérimentales ont été analysées selon un

modèle hyperbolique simple (Équation 15, p.67). La température est fixée à 25°C et la concentration

de TCEP à 2 mM.

complexe Yap1SSS SSS·Ybp1 a ensuite été étudiée. Pour cela, nous avons utilisé des

concentrations équimolaires de Yap1SSS SSS et Ybp1 de 50 μM, conditions dans lesquelles 90%

des deux protéines existent sous forme de complexe selon la constante de dissociation de

0,7 μM déterminée auparavant (Figure 34 A, p.68). Dans ces conditions, l’ajustement des

données expérimentales permet de déterminer une constante d’affinité de 0,7 ± 0,2 μM et une

stoechiométrie de 0,8 ± 0,1 (Figure 38 C, données et profil en noir).

Orp1 sous forme réduite interagirait donc avec le complexe Yap1SSS SSS·Ybp1 et avec

Ybp1 avec une stoechiométrie proche de 1 et des affinités similaires. Une hypothèse

alternative serait que le signal calorimétrique observé résulterait de l’interaction entre Orp1 et

Ybp1, qui induirait la dissociation du complexe Yap1SSS SSS·Ybp1. Néanmoins, étant donné les

constantes de dissociation des complexes Yap1SSS SSS·Ybp1 et Orp1·Ybp1, aucune saturation

n’aurait pu être observée dans les conditions de concentration utilisées. La protéine Orp1 sous

forme réduite interagit donc bien avec le complexe Yap1SSS SSS·Ybp1.

A. B. C.

Figure 38. Caractérisation des interactions entre Orp1 et Yap1, Ybp1 et le complexe

Yap1·Ybp1 par microcalorimétrie de titration isotherme.

L’acquisition des données a été réalisée à l’aide d’un appareil ITC 200 (GE Healthcare). Les données

représentées en noir ont été obtenues en présence de Orp1 sous forme réduite. Les données

représentées en rouge ont été obtenues en présence de Orp1SS. L’agitation est fixée à 750 rpm et la

température à 25°C. Les expériences sont réalisées dans le tampon D.

A. Caractérisation de l’interaction entre Ybp1 et Orp1 sous forme réduite et oxydée disulfure par ITC.

La cellule contient Ybp1 (20 μM) et la seringue Orp1 (200 μM). B. Caractérisation de l’interaction

entre Yap1SSS SSS

et Orp1 sous forme réduite et oxydée disulfure. La cellule contient Yap1SSS SSS

(50 μM) et la seringue Orp1 (500 μM). C. Caractérisation de l’interaction entre le complexe

Yap1SSS SSS

·Ybp1 et Orp1 sous forme réduite et oxydée disulfure. La cellule contient un mélange

équimolaire des protéines Yap1SSS SSS

Une série de titrations similaires a été effectuée en présence de Orp1_SS

(Figure 38, p. 73, données en rouge). Cependant, aucun signal calorimétrique significatif n’a

pu être détecté, suggérant que la formation du pont disulfure intramoléculaire de Orp1 est

associée à des réarrangements structuraux qui empêcheraient la reconnaissance de Orp1SS

par Ybp1 et par le complexe Yap1SSS SSS·Ybp1. Les spectres de dichroïsme circulaire de Orp1

réduite et Orp1_SS confirment cette hypothèse : la formation du pont disulfure intramoléculaire

entraîne une modification majeure du contenu en structure secondaire (Figure 39).