Production et purification de la protéine Ybp1

La protéine Ybp1 de S. cerevisiae a été produite dans la souche E. coli RosettaTM 2

(DE3) transformée par le plasmide recombinant pET28b ybp1 codant la séquence de la

protéine Ybp1 fusionnée à l’étiquette 6xHis du côté N-terminal. La protéine Ybp1 a été

Figure 30. Gel bilan de purification de Yap1.

Le marqueur de taille utilisé (MT) comprend la MsrA (24 kDa), la glycéraldéhyde 3 phosphate

déshydrogénase (GAPDH) (37,8 kDa), la protéine TruD (43 kDa), la rétinal déshydrogénase 2

(53 kDa), l’albumine de sérum bovin (62 kDa) et l’ARN polymérase T7 (97 kDa). SSO : surnageant

de sonication, Ni : éluat de la chromatographie d’affinité sur complexe Ni2+

immobilisé, Q : éluat de

la chromatographie échangeuse d’anions Q-sepharose.

purifiée en deux étapes qui ont permis d’une part, l’élimination des contaminants nucléiques,

attestée par l’augmentation du rapport DO₂₈₀/DO₂₆₀, et d’autre part l’élimination des

contaminants protéiques, suivie par analyse sur gel d’électrophorèse SDS-PAGE (Figure 31

A, p.61). La première étape consiste en une chromatographie d’affinité sur complexe Ni2+

immobilisé. La seconde étape correspond à une chromatographie par filtration sur gel.

Initialement, le protocole de production de la protéine Ybp1 consistait en une culture

de 18 heures dans le milieu Graffinity supplémenté en Kanamycine (50 mg/mL) et

Chloramphénicol (50 mg/mL). Ces antibiotiques sont utilisés respectivement comme moyen

de sélection des cellules recombinantes pour le plasmide pET28b ybp1 et le plasmide

pRARE2 de la souche RosettaTM 2 (DE3). Les cellules récoltées étaient ensuite reprises dans

le tampon A (Tris 50 mM, KCl 150 mM, pH 7), lysées par sonication, puis la protéine

d’intérêt était purifiée selon le protocole énoncé ci-dessus. Dans ces conditions, le rendement

de purification de la protéine Ybp1 purifiée était égal à 0,8 mg de protéine par litre de culture,

ce qui était trop faible pour permettre l’étude in vitro de cette protéine par des approches de

cinétique rapide. On peut observer sur le gel bilan de purification qu’une majorité de la

protéine d’intérêt était retrouvée dans la fraction cellulaire insoluble (Figure 31 A, p.61, piste

CSO). De plus, le pic majoritaire obtenu par chromatographie par filtration sur gel

préparatrice de type Superdex 200 (domaine de fractionnement de 10 à 600 kDa)

(Figure 31 C, p.61, profil orange) est élué dans le volume mort de la colonne, et correspondait

donc à des aggrégats de haut poids moléculaire et/ou à des formes non repliées de la protéine.

Les conditions de production ainsi que le tampon de solubilisation de Ybp1 ont alors été

optimisés dans le but d’améliorer la solubilité et la quantité de protéine purifiée.

Dans un premier temps, le protocole de production a été modifié. Premièrement, la

culture a été réalisée en milieu LB avec un choc thermique (1h à 47°C) et un choc osmotique

(500 mM NaCl et 2 mM bétaïne) imposés juste avant l’étape d’induction (322). Le choc

thermique permet l’expression d’un ensemble de gènes spécifiques dont la plupart codent des

chaperons moléculaires (284). Ces derniers ont plusieurs actions : certains désagrègent les

protéines agrégées mal repliées, d’autres présentent un rôle actif dans les processus de

repliement et empêchent ainsi l’agrégation protéique (285). Le choc osmotique entraîne

l’adaptation des bactéries à ces nouvelles conditions de haute pression osmotique en

accumulant de petits composés organiques appelés osmolytes, ici, la bétaïne. Ces osmolytes

jouent le rôle de chaperons chimiques : ils augmentent la stabilité des protéines natives (327)

et assistent le repliement des protéines (328). Deuxièmement, les antibiotiques Kanamycine et

Figure 31. Optimisation de la production et de la solubilité de Ybp1.

A. Gel bilan comparatif de purification de la protéine Ybp1 avant et après optimisation du protocole

de production et du tampon de solubilisation. Le marqueur de taille (MT) est identique à celui décrit

Figure 30, p.59. AI : dépôt de cellules entières avant induction, PI : dépôt de cellules entières après

induction, SSO : surnageant de sonication, CSO : culot de sonication, Ni : éluat de l’étape de

chromatographie d’affinité sur complexe Ni2+

, S200 : éluat de l’étape de chromatographie par

filtration sur gel de type Superdex 200. L’astérisque (*) indique un résultat obtenu dans des conditions

optimisées. B. Caractérisation du PdI d’une solution de protéine Ybp1 à 1 mg/mL en fonction du pH

et de la concentration en NaCl. Les mesures ont été réalisées à 25°C, dans le tampon Na2HPO4 à 20

mM additionné de 0 ; 0,2 ; 0,5 ou 1 M de NaCl à pH 7, 8 ou 9. C. Chromatogrammes de l’étape de

chromatographie par filtration sur gel de type Superdex 200 avant et après optimisation. L’éluat de

l’étape de chromatographie sur complexe Ni²⁺ immobilisé est fractionné sur une colonne de filtration

sur gel préparatrice de type Superdex 200 hiload 26/60 (GE Healthcare, domaine de fractionnement

de 10 à 600 kDa) préalablement étalonnée à l’aide de marqueurs de masses moléculaires connues

(Figure 64, p.125). Cette étape de purification est réalisée dans le tampon A avant optimisation et dans

le tampon B après optimisation. Le volume mort de la colonne est de 115 mL. Le Ve de la protéine

Ybp1 est de 196 mL, correspondant à une masse moléculaire apparente de 80 kDa identique à la

masse moléculaire théorique pour cette protéine (80 kDa). Les masses moléculaires de 670, 158, 44 et

17 kDa correspondent respectivement aux marqueurs de masse moléculaire connue (Bio-Rad)

thyroglobuline, γ-globuline, ovalbumine et myoglobine.

A.

C.

B.

cellules recombinantes d’intérêt, mais ont été supprimés dans l’étape de culture.

Ces antibiotiques, qui font respectivement partie de la famille des aminoglycosides et des

phénicolés, ont pour cible le ribosome bactérien et sont donc des inhibiteurs de la traduction

et de la croissance des micro-organismes. Leur suppression a permis d’augmenter à la fois la

biomasse et la quantité de protéine d’intérêt produite.

Dans un deuxième temps, nous avons étudié la solubilité de la protéine Ybp1 dans

différentes conditions de pH et de force ionique. Le comportement en solution de la protéine

Ybp1 purifiée a été étudié par DLS (pour « Dynamic Light Scattering » ou diffusion

dynamique de la lumière) en suivant l’indice de polydispersité (PdI) de la solution protéique

dans différentes solutions de pH et concentrations en NaCl variables. Une valeur de PdI

inférieure à 0,2 signifie que la solution protéique est monodisperse et non agrégée

(Figure 31 B, p.61). La protéine Ybp1 est donc monodisperse pour des valeurs de pH

supérieures à 7 et des concentrations en NaCl supérieures à 200 mM. Cette étude nous a

permis de définir une solution tampon de purification idéale pour la protéine Ybp1,

le tampon B (Hepes 20 mM ; NaCl 400 mM ; pH 8,5) qui a remplacé le tampon A dans lequel

la protéine Ybp1 était polydisperse.

Ces nouvelles conditions ont permis d’augmenter de plus de dix fois le rendement de

purification de la protéine Ybp1 qui est passé de 0,8 à 8,1 mg de protéine purifiée par litre de

culture. Cette augmentation peut être attribuée majoritairement à l’amélioration de la

solubilité de la protéine Ybp1 et de façon minoritaire à l’augmentation de la quantité de

protéine produite. En effet, la proportion de protéine d’intérêt présente dans le surnageant de

sonication par rapport au culot de sonication avant et après optimisation est inversée au profit

du surnageant de sonication (Figure 31 A, p.61, pistes SSO, CSO et SSO*, CSO*). Au niveau

des chromatogrammes de chromatographie par filtration sur gel, alors que dans les conditions

non optimisées le pic présentant un volume d’élution (Ve) égal au volume mort de la colonne

est largement majoritaire, celui-ci devient largement minoritaire après optimisation au profit

d’un pic présentant un Ve correspondant à une protéine de 80 kDa de masse moléculaire

apparente, la masse moléculaire de Ybp1 étant de 80 kDa. À partir de ces résultats, on peut

conclure que la protéine Ybp1 est purifiée sous forme monomérique, soluble et repliée.

Le rapport DO₂₈₀/DO₂₆₀ mesuré à l’issue de l’étape de chromatographie par filtration sur gel

Dans le document Les peroxydases à thiol, relais dans la signalisation cellulaire redox associée au peroxyde d’hydrogène : mécanismes moléculaires responsables de la spécificité de l’activation du facteur de transcription Yap1 chez Saccharomyces cerevisiae (Page 97-101)