Détermination de la stoechiométrie du complexe Yap1·Ybp1

a.Chromatographie par filtration sur gel

La stoechiométrie de l’interaction entre les protéines Yap1 sauvage et Ybp1 a été

étudiée par chromatographie par filtration sur gel. Pour cela, nous avons utilisé une colonne

Superdex 200 10/300 analytique (GE Healthcare, domaine de fractionnement de 10 à 600

kDa) préalablement étalonnée à l’aide de marqueurs de masses moléculaires connues

(Figure 68, p.132). L’élution est suivie par la mesure de l’absorption à 280 nm.

Dans un premier temps, des quantités équivalentes de chaque protéine ont été

fractionnées séparement sur la colonne (Figure 35, p.69, profils bleu et rouge).

Figure 34. Suivi de l’interaction entre Yap1 et Ybp1 par anisotropie de fluorescence.

L’anisotropie de fluorescence a été mesurée à l’aide d’un spectrofluorimètre SAFAS Xenius XC.

La longueur d’onde d’excitation est fixée à 494 nm et les fentes à 10 nm. L’émission de fluorescence

est collectée à 523 nm. Le mélange réactionnel est composé de 100 nM de protéine marquée et d’une

concentration variable de partenaire non marqué dans le tampon D. Les données expérimentales ont

été analysées selon un modèle hyperbolique simple (Équation 15, p.67). La température est fixée à

25°C en présence de TCEP 2mM.

A. Titration « miroir » des protéines Yap1 sauvage et Ybp1, B. Contrôles.

Le chromatogramme de Ybp1 présente un pic majoritaire caractérisé par un Ve de 13,3 mL

correspondant à une masse moléculaire apparente de 100 kDa, soit une valeur proche de la

masse moléculaire théorique du monomère de cette protéine (80 kDa). Ce résultat suggère que

Ybp1 existe majoritairement sous forme de monomère en solution. Le chromatogramme

obtenu pour Yap1 sauvage présente un pic majoritaire caractérisé par un Ve de 9,9 mL,

correspondant à une masse moléculaire apparente de 470 kDa. Cela implique que la protéine

Yap1 sauvage, dont la masse moléculaire calculée pour un monomère est de 75 kDa, pourrait

s’associer en oligomère et/ou adopterait une conformation non globulaire en solution.

Cette dernière hypothèse est cohérente avec la faible proportion de structures secondaires

mise en évidence pour la forme réduite de Yap1 révélée par des expériences de dichroïsme

circulaire (Figure 66, p.129). Enfin, un pic minoritaire est élué dans le volume mort de la

colonne, ce qui indique qu’une faible proportion de la protéine existe sous forme agrégée dans

les conditions expérimentales utilisées.

Dans un deuxième temps, un mélange équimolaire des deux protéines a été

fractionné sur la colonne (Figure 35, profil rose). Le chromatogramme présente un pic

majoritaire caractérisé par un Ve de 10,8 mL correspondant à une masse moléculaire

apparente de 307 kDa, et deux épaulements largement minoritaires correspondant aux

Figure 35. Profils d’élution de chromatographie par filtration sur gel de Yap1 sauvage et Ybp1.

Des volumes de 200 μL d’une solution de protéine Yap1 sauvage à 30 μM, Ybp1 à 30 μM ou d’un

mélange de ces deux protéines à un ratio de 1:1 et 2:1 ont été fractionnés sur une colonne de

chromatographie par filtration sur gel de type Superdex 200 10/300 analytique (GE Healthcare)

préalablement équilibrée dans le tampon D. L’élution des différentes espèces a été suivie par la

mesure de la DO à 280 nm. Les masses moléculaires de 670, 158 et 44 kDa correspondent

respectivement aux marqueurs de masses moléculaires connues (Bio-Rad) thyroglobuline,

protéines Yap1 sauvage et Ybp1 libre. Dans un troisième temps, un mélange contenant deux

fois plus de Yap1 sauvage que de Ybp1 a été fractionné sur la colonne (Figure 35, profil

violet, p.69). Le chromatogramme présente deux pics quasiment équivalents, l’un

correspondant à Yap1 sauvage libre et l’autre correspondant à l’espèce de masse moléculaire

apparente de 307 kDa.

La masse moléculaire théorique d’un complexe Yap1·Ybp1 1:1 étant de 153 kDa,

l’ensemble de ces résultats suggère soit que les protéines Yap1 et Ybp1 s’associent en un

complexe 2:2, soit en un complexe 1:1 de conformation non globulaire.

b. Par spectrométrie de masse en conditions natives

Afin de lever l’incertitude sur la stoechiométrie du complexe Yap1·Ybp1, des

expériences ont été menées par spectrométrie de masse en conditions natives en collaboration

avec le laboratoire LSMBO (Strasbourg) dirigé par S. Cianferani (Figure 36).

Figure 36. Analyse du complexe binaire copurifié Yap1·Ybp1 par spectrométrie de masse en

conditions natives.

Spectre de masse non déconvolué du complexe binaire Yap1·Ybp1. Un mélange équimolaire des

protéines Yap1SSS SSS

et Ybp1 à une concentration de 50 �M a été fractionné sur une colonne de

filtration sur gel de type Superdex 200 10/300 analytique (GE Healthcare) préalablement équilibrée

en acétate d’ammonium 500 mM, pH 8. Le pic correspondant au complexe Yap1SSS SSS

·Ybp1 (Ve =

10,8 mL, Figure 35, p.69) est collecté puis stocké à une température de -80°C, après congélation par

immersion en azote liquide. Cette espèce a ensuite été analysée par spectrométrie de masse en

conditions natives à une concentration de 5 �M après dilution dans le tampon acétate d’ammonium

500 mM, pH 8. L’analyse est réalisée sur un spectromètre de masse de type électrospray (Synapt G2,

Waters). Triangle orange : distribution des états de charge (17+ à 21+) d’une espèce dont la masse de

79780 ± 6 Da correspondant à Ybp1 (masse moléculaire théorique de 79772,9 Da), triangle orange et

carré bleu : distribution des états de charge d’une espèce dont la masse de 154296 ± 9 Da correspond

à un complexe Yap1·Ybp1 de stoechiométrie 1:1 (masse moléculaire théorique de 154241 Da). Les

Le spectre de masse du complexe copurifié formé entre Yap1SSS SSS et Ybp1 révèle la

présence de deux espèces dont les masses moléculaires sont égales à 79780 ± 6 et

à 154296 ± 9 Da, correspondant respectivement aux masses théoriques de la protéine Ybp1

(79772,9 Da) et du complexe Yap1SSS SSS·Ybp1 de stoechiométrie 1:1 (154241 Da). Dans ces

conditions natives, les différences entre les masses moléculaires expérimentales et théoriques

peuvent s’expliquer par une désolvatation non totale de l’échantillon nécessaire afin d’éviter

la dissociation du complexe non covalent entre les protéines Yap1 et Ybp1.

Ces résultats établissent sans ambiguité que la stoechiométrie de l’interaction entre

Yap1 et Ybp1 est de 1:1.

B. Étude des interactions entre la protéine Orp1 et les protéines Yap1,