CHAPITRE 7 - DISCUSSION GENERALE
7.3.5. Rationalisation de l’affinité pour la protéine TIP-1
Les résultats obtenus pour les séquences iCAL-Q6 et iCAL-Q13, associés à l’analogie des peptides iCAL36 et iCAL-Q6 d’une part, et iCAL42 et iCAL-Q13 d’autre part nous laissent penser que le résidu P-5 est l’acteur principal de la convolution de l’affinité des peptides iCAL pour les protéines CALP et TIP-1. Le remplacement de cette position par un résidu non-analogue au tryptophane pourrait donc résulter en une diminution de l’affinité pour les deux protéines. Toutefois, il est envisageable que des effets synergiques de la position P-5
avec les positions P0, P-1 et P-4 soient également à l’œuvre.
Une analyse combinatoire des positions P-1 et P-4 sur un ensemble réduit de séquences n’a démontré aucun rôle significatif de la position P-4 (Figure 6.9). En revanche, une analyse conjointe des positions P-1 et P-5 de la séquence ANSRWPTSIτ a démontré que la position P-1 module l’interaction avec la protéine TIP-1, et rend possible l’identification de séquences contenant un résidu analogue du tryptophane en position P-5
et présentant une faible interaction avec la protéine TIP-1 (Figure 6.8). En particulier, la cyclohexylglycine (ν) a été à nouveau identifiée comme prometteuse en position P-1. Une séquence hybride entre iCAL-Q6 et iCAL-Q13 a donc pu être identifiée : ANSRωεTSντ. Afin de confirmer l’effet prometteur de l’introduction d’un résidu tert-leucine (α) en position P-3 (thréonine → α) issue de l’analyse de substitution (Figure 6.2), nous avons finalement défini deux séquences nous permettant, en comparaison avec iCAL-Q6, d’étudier l’influence des positions P0 et P-3 : ANSRωεαSνρ (iCAL-Q27) et ANSRωεαSντ (iCAL-Q28) (Tableau 7.5).
Conformément aux résultats de synthèse SPOT, l’insertion de la tert-leucine en position P-3 a mené à une hausse significative d’affinité des peptides pour la protéine CALP. Les constantes d’affinité des interactions CALP/iCAL-Q27 et CALP/iCAL-Q28 ont été estimées de l’ordre de 100-300 nM (Tableau 6.4), ce qui en fait les plus puissants inhibiteurs de la protéine CALP identifiés à ce jour. Aucune interaction des peptides avec la protéine N2P2 n’a également été constatée, conformément au criblage par synthèse SPOT. En revanche, et de façon étonnante au vu des résultats de synthèse SPOT, ces deux peptides ont également démontré une très forte interaction pour TIP-1. En particulier, le peptide iCAL-Q27 a démontré une affinité d’environ 10 nM pour cette protéine, ce qui en fait une interaction extrêmement forte comparée aux interactions peptide/PDZ précédemment identifiées361. La position P0 joue également un rôle, modulant d’un facteur 3 à 5 l’affinité du peptide pour les protéines CALP et TIP-1. Toutefois, aucune de ces deux positions n’a semblé permettre de rompre le parallélisme de l’interaction entre ces deux protéines.
Malgré sa forte interaction avec la protéine TIP-1, le peptide iCAL-Q27 présente une affinité pour la protéine CALP environ 70 fois plus élevée que le peptide iCAL36, ce qui en fait un excellent candidat pour des tests d’activité biologiques. De plus, les caractéristiques exceptionnelles de ce peptide lui permettront de servir de base pour le développement de nouveaux peptides iCAL. Une possibilité serait par exemple de développer un analogue du peptide iCAL-Q27 présentant un résidu aliphatique en position P-5, ce qui permettrait de développer un analogue d’iCAL42 renforcé par la contribution favorable des positions P0, P-1
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Tableau 7.5. Séquences des peptides iCAL-2G identifiées au cours de ces travaux.
Les AANN sont représentés en bleu. Les séquences surlignées en jaune ont été synthétisées et leur affinité pour les protéines CALP, N2P2 et TIP-1 a été mesurée.
7.3.6. Conclusion
A l’issue des travaux développés dans la deuxième partie de cette thèse, nous avons été en mesure d’identifier de nouvelles séquences analogues du peptide iCAL36 (Tableau 7.5 et 7.6). Quatre d’entre elles ont été synthétisées et leurs interactions avec les protéines CALP, N2P2 et TIP-1 ont été quantifiées (Figures 7.3 et 7.4). En particulier, le peptide iCAL-Q27 (ANSRωεαSνρ) présente une affinité pour la protéine CALP 70 fois supérieure à celle observée pour le peptide iCAL36 tout en n’ayant pas d’interaction mesurable avec la protéine N2P2, ce qui en fait un inhibiteur extrêmement puissant du domaine PDZ de la protéine CALP (Ki ≈ 100 nM). Il est donc probable qu’il permette d’observer un effet biologique accru en comparaison avec iCAL36, ou tout du moins un effet biologique atteignable avec de plus faibles concentrations de peptide. Nous avons également identifié quelques-uns des déterminants de l’interaction TIP-1/iCAL. Conformément à des études non-publiées précédemment réalisées par notre groupe, la présence d’un tryptophane ou d’un analogue proche de ce résidu en position P-5 du peptide iCAL36 mène à une forte interaction avec la protéine TIP-1. Le remplacement de ce résidu par un acide aminé aliphatique diminue fortement l’interaction pour la protéine TIP-1, mais réduit également l’affinité du peptide pour la protéine CALP. Deux stratégies semblent donc envisageables à l’avenir : l’introduction d’un résidu aliphatique en position P-5 menant à l’abolition de l’interaction TIP-1/iCAL et de résidus divers aux positions P0, P-1 et P-3
pouvant renforcer l’interaction CALP/iCAL ; ou la poursuite de l’identification de résidus permettant l’abolition de l’interaction TIP-1/iCAL sur d’autres positions.
Nom Séquence Nom Séquence
iCAL-Q14 ANSRωPTSγτ iCAL-Q1 ANSRWεαηνI iCAL-Q15 ANSRχPTSγτ iCAL-Q16 ANSRωτTSγτ iCAL-Q2 ANSRWPTSνρ iCAL-Q17 ANSRχτTSγτ iCAL-Q6 ANSRωεTSνρ iCAL-Q18 ANSRχεTSγτ iCAL-Q7 ANSRχεTSνρ iCAL-Q19 ANSRκεTSγτ iCAL-Q8 ANSRκεTSνρ iCAL-Q20 ANSRχPTSγτ iCAL-Q9 ANSRωτTSνρ iCAL-Q26 ANSRωPTSγτ iCAL-Q10 ANSRχτTSνρ iCAL-Q4 ANSRWPTSΗτ iCAL-Q11 ANSRωPTSνρ iCAL-Q23 ANSRωPTSΗτ iCAL-Q12 ANSRχPTSνρ iCAL-Q22 ANSRχPTSρτ iCAL-Q27 ANSRωεαSνρ iCAL-Q24 ANSRχPTSατ iCAL-Q29 ANSγωεαSνρ iCAL-Q21 ANSRωPTSντ iCAL-Q30 σSγωεαSνρ iCAL-Q25 ANSRχPTSντ iCAL-Q28 ANSRωεαSντ iCAL-Q3 ANSRWPTSγτ
iCAL-Q13 ANSRγPTSγτ iCAL-Q5 ANSRWPTSνΕ Position P0 = I
Position P0 = ρ
Position P0 = Ε Position P0 = τ
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Tableau 7.6. Affinité des peptides iCAL pour les protéines CALP, TIP-1 et N2P2.
Affinité CALP TIP-1 N2P2
iCAL36 o + -- iCAL-Q6 + ++ -- iCAL-Q13 - - -- iCAL-Q27 ++ +++ -- iCAL-Q28 ++ ++ -- +++ : < 50 nM ; ++ : 50-300 nM ; + : 0,3-2 µM ; o : 2-20µM ; - : 20-100 µM ; -- : > 100 µM.
Figure 7.3. Structure chimique des peptides iCAL36, iCAL-Q6, iCAL-Q13, iCAL-Q27 et iCAL-Q28. Les acides aminés mutés par rapport à la séquence du peptide iCAL36 sont indiqués en rouge.
Enfin, les travaux réalisés ont également permis d’identifier des remplacements intrinsèquement intéressants pour le développement de nouveaux peptides iCAL : en particulier, la présence d’un résidu tert-leucine (α) en position P-3 semble apporter une forte hausse d’affinité pour la protéine CALP, qui au vu des résultats d’analyse de substitution semble indépendante des autres résidus de la séquence.
Ces résultats ne sont toutefois que le début d’un criblage de peptides iCAL-2G incluant des AANN : pour des raisons de temps, seule une fraction des séquences identifiées a été testée au-delà du criblage SPOT. Dans un futur proche, d’autres de ces séquences seront synthétisées et analysées en polarisation de fluorescence de façon à comprendre de façon plus détaillée le rôle de chaque substitution ponctuelle. En parallèle, la stabilité métabolique de tous les peptides iCAL-2G en présence de protéases sera étudiée par HPLC-MS : un protocole a d’ores et déjà été développé et permet l’incubation des peptides avec 20% de sérum humain, la précipitation des protéines sériques par l’acétonitrile et l’analyse du surnageant contenant le peptide et ses métabolites par HPLC, en présence d’un étalon interne permettant de quantifier chaque composé identifié. Ce protocole sera prochainement appliqué aux peptides iCAL36, T36, TRI36 et aux peptides iCAL incluant des AANN, et permettra d’étudier l’influence des remplacements sur la stabilité métabolique globale du peptide.
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Figure 7.4. Comparaison de l’affinité des peptides iCAL36, iCAL-Q6, iCAL-Q13, iCAL-Q27 et iCAL-Q28 pour CALP, N2P2 et TIP-1 par FP.
Les courbes expérimentales (en pointillé) sont fittées, lorsque possible, par une courbe de valeurs calculées (en trait plein) qui est exploitée pour le calcul de la valeur de Ki. (B) Interaction des peptides avec la protéine CALP. (B) Interaction des peptides avec la protéine TIP-1. (C) Interaction des peptides avec la protéine N2P2 .Les courbes sont représentatives d’un des réplicas techniques réalisés.