Implication de voies d’endocytose spécifiques dans le mécanisme d’internalisation de TRI36 et de

Les CPP entrant dans la cellule par endocytose peuvent suivre trois voies principales : l’endocytose clathrine-dépendante, cavéoline-dépendante ou la macropinocytose. Afin de déterminer lesquelles de ces voies sont impliquées dans l’internalisation cellulaire des conjugués *TRI36 et *P36, nous avons réalisé des expériences de colocalisation de ces conjugués avec des marqueurs spécifiques d’endocytose. Les cellules ont été co-incubées avec les conjugués *TRI36 (5 µM) ou *P36 (1 µM) et l’un des marqueurs d’endocytose suivants dans l’OptiMEM pendant 1,5 heures (Figure 4.11).

- La transferrine (portant une sonde Alexa-488 : Transferrine-488) pénètre les cellules exclusivement par endocytose clathrine-dépendante ;

- La sous-unité B de la toxine du choléra (avec une sonde Alexa-488 : CtB-488) suit sélectivement l’endocytose cavéoline-dépendante ;

- Le dextran (avec marquage pHrodo Green : Dextran-Green) est un substrat sélectivement internalisé par macropinocytose.

La colocalisation de *TRI36/*P36 avec CtB-488 ou Dextran-Green est relativement forte, alors que la colocalisation avec la transferrine-488 est plus modérée. Pour confirmer la spécificité de cette colocalisation, le signal des marqueurs seuls a également été enregistré. Le signal de Transferrine-488 et de Dextran-Green est fort et homogène ; en revanche le signal de CtB-488 seul est extrêmement faible, alors qu’en présence de *TRI36/*P36 on observe un fort signal intracellulaire de CtB-488 qui colocalise avec le peptide. Ces résultats semblent indiquer que CtB-488 est internalisée par la cellule par interaction avec les conjugués *CPP-iCAL36, et que l’endocytose cavéoline-dépendante est faiblement efficace dans les cellules Caco-2. Dans ce cas, le mécanisme d’entrée des peptides ne nécessiterait pas exclusivement l’endocytose cavéoline-dépendante.

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Figure 4.11. Images représentatives de la colocalisation de *TRI36 et de *P36 avec des marqueurs d’endocytose dans des cellules Caco-2.

Les cellules ont été ensemencées dans des boites de microscopie à fond en verre (300.000 c/mL) puis cultivées 36 h à 37°C, 5% CO2, avant d’être co-incubées pendant 1,5 h avec *TRI36 (5 µM) ou *P36 (1 µM) et l’un des marqueurs Transferrine-488 (A), CtB-488 (B) ou Dextran-Green (C) dans l’OptiMEM, puis marquées avec Hoechst 33342 (bleu), lavées et observées. La colocalisation entre le peptide (rouge) et le marqueur d’endocytose (vert) apparait en jaune. De façon similaire pour les deux peptides, la colocalisation avec CtB-488 et Dextran-Green est marquée, alors que la colocalisation avec Transferrine-488 est plus modeste. Le signal de fluorescence de CtB-488 est très peu visible en absence de *CPP-iCAL36, ce qui pourrait souligner une faible efficacité de l’endocytose cavéoline-dépendante dans les cellules Caco-2.

111 Pour élucider cette question, des cellules Calu-3 ont été transfectées avec CtB-488 en absence et en présence des peptides *TRI36 ou *P36. En absence de peptide, CtB-488 donne un signal intracellulaire visible et homogène dans le cytosol. En présence du peptide, le signal de CtB-488 reste homogène, en contraste avec le peptide qui présente un signal ponctué et un faible degré de colocalisation avec CtB-488 (données non-présentées). Il est donc très probable que les cellules Caco-2 n’internalisent CtB-488 que lorsqu’elle est complexée aux conjugués *CPP-iCAL36, par une voie indépendante de la cavéoline.

Afin de mieux comprendre ces résultats, nous avons étudié l’effet d’inhibiteurs spécifiques de ces voies d’endocytose sur l’efficacité de transfection des conjugués *TRI36 et *P36. En effet, ces mécanismes impliquent des interactions avec des partenaires spécifiques qui peuvent donc être saturés ou inhibés pharmacologiquement. L’inhibition d’une voie d’endocytose et la mesure de l’efficacité de transfection d’un CPP ou d’un CPP-conjugué dans ces conditions permettraient donc, par comparaison, d’estimer l’importance de cette voie dans le mécanisme d’entrée du peptide. Les inhibiteurs suivants ont été utilisés :

- La chlorpromazine (CPZ) est un inhibiteur sélectif de l’endocytose clathrine-dépendante297–299 ; - La nystatine (NYS) permet d’inhiber sélectivement l’endocytose cavéoline-dépendante297 ;

- La méthyl-β-cyclodextrine (MbCD) inhibe la macropinocytose298,299, mais peut aussi affecter l’endocytose cavéoline-dépendante297.

Les cellules Caco-2 ont été prétraitées pendant 30 min par l’un des trois inhibiteurs d’endocytose, puis les conjugués *TRI36 (5 µM) ou *P36 (1 µM) ont été ajoutés pour une incubation de 1,5 heures (Figure 4.12).

Figure 4.12. Influence de l’inhibition sélective des voies d’endocytose sur la transfection de *TRI36 et de *P36 dans des cellules Caco-2.

Des cellules Caco-2 ont été ensemencées dans des plaques 24 puits puis cultivées 36 h à 37°C, 5% CO2

avant d’être prétraitées par un inhibiteur d’endocytose (CPZ, NYS ou MbCD) pendant 30 min, puis incubées dans ces conditions avec les conjugués *TRI36 (5 µM) ou *P36 (1 µM) dans l’OptiMEM pendant 1,5 h. Les échantillons cellulaires ont été lavés, trypsinés, centrifugés, repris dans un tampon contenant 0,1% de DAPI puis analysés par cytométrie de flux. NT : cellules non-traitées. Le traitement par les inhibiteurs d’endocytose induit une cytotoxicité significative, mais ne provoque pas de perte significative de l’efficacité de transfection des deux peptides.

Le traitement des cellules Caco-2 par CPZ, NYS ou MbCD induit une légère cytotoxicité (5-20% de perte de viabilité) par rapport aux cellules non-traitées (80% ± 10%). Toutefois, les inhibiteurs d’endocytose ne mènent à aucune variation significative de la fluorescence intracellulaire des peptides *TRI36 et *P36 : seules de légères diminutions (22-29%) non-significatives sont observables en présence de NYS pour les peptides *TRI36 et *P36, et en présence de MbCD pour le peptide *TRI36 (22%).

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Il n’est donc pas possible de clairement déduire de ces résultats quelles voies d’endocytose sont empruntées par les peptides. Cependant, ces résultats peuvent aussi indiquer que lorsque l’une des voies d’endocytose est inhibée, d’autres voies peuvent alors être impliquées dans l’internalisation des peptides.

En conclusion, ces résultats semblent indiquer que les peptides *TRI36 et *P36 peuvent suivre une ou plusieurs voies d’endocytose, mais il est difficile de déterminer avec certitude lesquelles de ces voies sont employées. Il serait intéressant de tester d’autres inhibiteurs ou marqueurs de ces voies pour mieux comprendre l’implication des différentes voies d’endocytose dans le mécanisme d’internalisation des conjugués CPP-iCAL36.