Quantification de l’affinité et de la sélectivité d’iCAL-Q27 et d’iCAL-Q28

Dans le but de confirmer les résultats obtenus par synthèse SPOT, les peptides iCAL-Q27 (ANSRωεαSνρ) et iCAL-Q28 (ANSRωεαSντ) ont été synthétisés sur résine, puis leur affinité pour les protéines CALP, N2P2 ou TIP-1 a été mesurée par FP (Tableau 6.4, Figure 6.10).

L’interaction des peptides iCAL-Q27 et iCAL-Q28 avec les protéines CALP et TIP-1 semble significativement plus élevée qu’avec le peptide iCAL-Q6 : comme précédemment, la force relative de ces interactions comparées aux interactions ligand fluorescent/protéine empêche la détermination précise des valeurs de Ki et nécessitera de répéter les expériences avec un ligand fluorescent plus affin, tel que le peptide iCAL-Q28 marqué.

Le peptide iCAL-Q28 semble indiquer une absence d’interaction avec la protéine N2P2 (Ki > 1 mM). Pour la séquence iCAL-Q27, il est plus difficile de conclure car la diminution de signal à la concentration maximale de peptide iCAL-Q27 semble non-significative, mais est prise en compte lors du tracé de la courbe calculée : il faudrait répéter les expériences avec des quantités de peptide compétiteur plus élevées ou avec iCAL-Q27 marqué comme ligand fluorescent pour la protéine N2P2.

Tableau 6.4. Caractérisation in vitro de l’affinité et de la sélectivité d’iCAL-Q27 et d’iCAL-Q28.

Protéine CALP N2P2 TIP-1

Ki iCAL36 (µM) 6,89 ± 1,75 > 5 000 0,41 ± 0,25

Ki iCAL-Q6 (µM) 1,13 ± 0,30 > 1 000 < 0,05

Ki iCAL-Q13 (µM) 63,8 ± 24,0 > 1 000 62,2 ± 26,0

Ki iCAL-Q27 (µM) ≈ 0,1 > 100 ≈ 0,01

Ki iCAL-Q28 (µM) ≈ 0,3 > 1 000 < 0,1

Les valeurs de Ki (constante d’inhibition) correspondent à la dissociation du complexe peptide compétiteur/protéine d’intérêt. Moyennes et écarts-types réalisés sur 2 mesures indépendantes.

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Figure 6.10. Affinité des peptides iCAL-Q27 et iCAL-Q28 pour CALP, N2P2 et TIP-1 par FP.

Les courbes expérimentales (en pointillé) sont fittées par une courbe de valeurs calculées (en trait plein) qui est exploitée pour le calcul de la valeur de Ki. (A) Interaction du peptide iCAL-Q27 avec CALP (orange), N2P2 (bleu) et TIP-1 (vert). (B) Interaction du peptide iCAL-Q28 avec CALP (orange), N2P2 (bleu) et TIP-1 (vert). Les courbes sont représentatives d’un des réplicas réalisés.

En conclusion, il apparait que toutes les séquences synthétisées ont une affinité négligeable pour la protéine N2P2 et que l’affinité pour la protéine TIP-1 est toujours corrélée à l’affinité pour la protéine CALP, ce qui est inattendu mais possible car le criblage par synthèse SPOT ne permet pas de corréler linéairement le signal observé à l’affinité peptide/protéine. Si l’on compare visuellement les concentrations de peptide compétiteur requises pour atteindre 50% du signal de polarisation maximal, on peut réaliser les observations suivantes :

- Le peptide iCAL-Q27 semble 10 fois plus affin pour la protéine CALP (Ki ≈ 100 nM) et 4 fois plus affin pour la protéine TIP-1 (Ki ≈ 10 nM) en comparaison avec la séquence iCAL-Q6, indiquant un effet certain du remplacement de la position P-3 par la tert-leucine (α).

- Le peptide iCAL-Q28 semble 3 fois moins affin pour la protéine CALP (Ki ≈ 300 nM) et 8 fois moins affin pour la protéine TIP-1 (Ki ≈ 80 nM) en comparaison avec la séquence iCAL-Q27, indiquant que remplacer la norvaline (ρ) par l’acide 2-aminobutyrique (τ) en position P0 affecte légèrement l’affinité pour la protéine CALP, mais affecte un peu plus fortement celle pour la protéine TIP-1.

Les peptides iCAL-Q27 et iCAL-Q28 semblent donc avoir une affinité sub-micromolaire pour la protéine CALP sans pour autant interagir avec la protéine N2P2, ce qui en fait des séquences extrêmement prometteuses. Toutefois, l’interaction avec la protéine TIP-1 est également très forte pour ces peptides.

Conclusion

Nous avons pu identifier de nouvelles séquences peptidiques dérivées du peptide iCAL36. Certaines de ces séquences (iCAL-Q6, iCAL-Q27, iCAL-Q28) semblent permettre d’observer une affinité jusqu’à 100 fois accrue pour la protéine CALP, tout en maintenant une absence d’interaction avec la protéine N2P2. Les résultats obtenus montrent que les positions P0, P-1, P-3 et P-5 du peptide iCAL36 sont celles permettant le plus d’affecter l’affinité pour sa cible thérapeutique : en particulier, le remplacement de la thréonine (position P-3) par un résidu tert-leucine (α) a été déterminant.

153 L’affinité des peptides dérivés de la séquence iCAL36 pour la protéine CALP est corrélée à leur affinité pour la protéine TIP-1 : les séquences iCAL-Q6, iCAL-Q27 et iCAL-Q28 semblent systématiquement 3 à 20 fois plus affines pour la protéine TIP-1 que pour la protéine CALP. Dans le cas du peptide iCAL-Q13, l’affinité pour la protéine TIP-1 est diminuée d’un facteur 150, mais l’affinité pour la protéine CALP est également diminuée d’un facteur 10. L’association des résultats obtenus dans cette partie semble indiquer que la position P-5 des peptides dérivés du peptide iCAL36 est déterminante, et que pour développer des peptides faiblement affins pour la protéine TIP-1 il sera probablement nécessaire d’introduire à cette position un AANN structurellement éloigné du tryptophane, mais qui permet de maintenir une bonne affinité pour la protéine CALP. Alternativement, s’il est possible d’identifier des résidus abolissant l’interaction pour la protéine TIP-1 sur d’autres positions, il sera alors envisageable de conserver un AANN proche du tryptophane en position P-5.

Perspectives : autres séquences iCAL-2G

Lors de cette thèse, nous avons développé un protocole permettant l’analyse des métabolites de dégradation de peptides par les peptidases. Ce protocole prévoit l’incubation du peptide dans un milieu contenant 20% de sérum humain, puis l’extraction des protéines sériques par précipitation avec de l’acétonitrile (proportion finale : 67%). Le surnageant récupéré ne contient que le peptide et ses métabolites, qui peuvent ensuite être identifiés et séparés par chromatographie liquide haute performance (HPLC). Ce protocole a mis en évidence la dégradation extensive du peptide iCAL36 par les protéases après 3 heures d’incubation à 37°C avec 20% de sérum humain (données non-présentées). Il pourra donc être employé prochainement pour analyser la stabilité métabolique des différents peptides iCAL-2G.

En parallèle, de par la relative non-spécificité des positions P-6 à P-9 du peptide iCAL36 (Figure 6.2) il est possible de remplacer certains résidus par des AANN, ce qui pourrait apporter de la stabilité métabolique. En particulier, le remplacement de l’arginine en position P-6 permettrait d’immuniser le peptide à l’action de la trypsine et de ses analogues fonctionnels. Le remplacement de l’acide aminé N-terminal (position P-9) permettrait également de protéger le peptide contre les exopeptidases. L’insertion de résidus N-méthylés serait également envisageable.

Sur base des résultats précédents (Figure 6.2), nous avons donc défini deux séquences dérivant d’iCAL-Q27 avec les séquences suivantes : ANSγωεαSνρ (iCAL-Q29) et σSγωεαSνρ (iCAL-Q30). Il serait intéressant de synthétiser ces deux peptides de seconde génération et d’effectuer des analyses supplémentaires (affinité, sélectivité et stabilité).

Dans un futur projet, il serait intéressant de synthétiser toutes les séquences sélectionnées dans ce chapitre afin d’analyser leur stabilité métabolique en présence de sérum humain et leur affinité/sélectivité pour les protéines CALP, N2P2 et TIP-1 en comparaison avec le peptide iCAL36.

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Chapitre 7

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