R´esolution lat´erale d’un microscope confocal

3.2.4.1 Detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolos

As RONs foram caracterizadas utilizando-se impregnação pela prata idealizada por Howell & Black (1980), preparando-se previamente uma solução gelatinosa contendo 1 g de gelatina incolor acrescido de 50 ml de água e 0,5 ml de ácido fórmico. Adicionaram-se sobre as lâminas 300 µl de solução gelatinosa, 300 µl de nitrato de prata (AgNO3)50% e por fim, 150 µl

água destilada que foram homogeneizados e recobertas com lamínula. A lâmina com a solução em sua superfície foi colocada numa estufa a 60 ºC até que o filme da solução atingisse uma coloração âmbar. A solução e a lamínula foram retiradas da superfície da lâmina com um jato de água

destilada, seca a temperatura ambiente e então analisadas sob microscópio óptico.

3.2.4.2 Detecção de Heterocromatina Constitutiva

A revelação das regiões de heterocromatina constitutiva (bandamento C) foi realizada utilizando-se o método desenvolvido por Sumner (1972) com pequenas alterações, visando uma melhor qualidade das preparações. As lâminas após envelhecidas em estufa à 37 °C por um período de 72 horas, foram imersas em solução de HCl 0,2 N à temperatura ambiente, por 30 minutos, lavando-as logo em seguida em água destilada e deixadas a secar em temperatura ambiente. Após isso, foram incubadas à temperatura de 42 °C numa solução de Ba(OH)2.8H2O à 5% em períodos variáveis para cada

espécime (partindo-se de 1:30min e ajustados a medida que repetições desse procedimento disponibilizavam resultados mais aprimorados, aumentando-se ou diminuindo o tempo de exposição a cada novo procedimento), sendo em seguida lavadas brevemente com HCl 0,2 N e mantidas em solução de 2X SSC a 60 ºC em estufa por uma hora. Após esta fase as lâminas foram coradas com Giemsa 5% e analisadas.

3.2.4.3 Coloração com Fluorocromos CMA3 e DAPI

A coloração com o fluorocromo cromomicina A3 (CMA3) foi realizada

seguindo a técnica de Schweizer (1980), com pequenas modificações. Após um processo de desidratação por 30 minutos em solução fixadora (metanol 3:1 ácido acético) e 1 hora em etanol 100%, as lâminas foram secas ao ar e um total de 30 µl de solução cromomicina (CMA3) (0,5 mg/ml – 10 ml) foi depositado em cada lâmina, sendo as mesmas cobertas por lamínulas, permanecendo 1 hora em câmara escura umedecida.

Posteriormente, as lâminas foram lavadas em água destilada, utilizando-se de um jato moderado para a retirada das lamínulas. Depois as lâminas foram secas em temperatura ambiente no escuro e sobre sua superfície aplicaram-se 30 µl do meio de montagem (Glicerol-Macllvaine, pH 7,0, 1:1), sendo coberta com lamínulas e o conjunto selado com base incolor

de esmalte nas extremidades, para evitar que o meio de montagem se dispersasse durante a estocagem. As lâminas foram preservadas em câmara escura à temperatura ambiente por 4 dias e então analisadas utilizando-se os filtros microscópicos de fluorescência apropriados.

Após analisadas, as lâminas foram novamente submetidas à lavagem com água destilada, utilizando-se do jato moderado para a retirada das lamínulas e secas ao ar no escuro. Posteriormente sobre as mesmas foi depositado um total de 30 µl de solução de DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) (2 µg/ml – 10 ml), sendo cobertas novamente por lamínulas e permanecendo por 30 minutos em câmara escura umedecida. Novamente foram submetidas à lavagem com água destilada, utilizando-se do jato moderado para a retirada das lamínulas e secas ao ar no escuro. Por último, aplicou-se novamente 30 µl do meio de montagem (Glicerol-Macllvaine, pH 7,0; 1:1),sobre cada lâmina no escuro e sobre as mesmas depositaram-se as lamínulas, sendo o conjunto selado com base incolor de esmalte nas extremidades. As lâminas foram preservadas em câmara escura à temperatura ambiente por 4 dias e então analisadas utilizando-se os filtros microscópicos de fluorescência apropriados.

3.2.4.4 Hibridização Fluorescente in situ (FISH)

A hibridização in situ fluorescente (FISH) foi realizada de acordo com a metodologia descrita por Pinkel et al. (1986) com algumas modificações. A obtenção das sondas de DNAr foi realizada por PCR, designando-se dessa forma as sondas específicas para cada marcador. Dessa forma, para os marcadores ribossomais duas sequências foram isoladas do genoma da espécie de peixe Rachycentrum canadum (Euteleostei, Perciformes) e amplificadas utilizando-se os primers A 5’-TAC GCC CGA TCT CGT CG ATC-3’e B 5’-CGA GCT GGT ATG GCC GTA AGC-3’ (Pendás et al., 1994). A sonda DNAr 5S incluía 200 pares de bases (bp) do gene RNAr 5S e a de DNAr 18S corresponderam a um segmento de 1400 bp do gene RNAr 18S, obtido via PCR do DNA nuclear (Costa, 2015). Ambas as sondas foram marcadas por nick translation (Digoxigenina e Biotina – Nick TranslationMix, Roche) seguindo as recomendações do fabricante (Roche, Mannheim,

Alemanha), sendo a de DNAr 5S com biotina-14-dATP e a de DNAr 18S com digoxigenina-11-dUTP de acordo com as recomendações do fabricante (Roche, Mannheim, Alemanha).

As sondas do transposon Tol2 foram obtidas por PCR do DNA nuclear novamente de Rachycentron canadum utilizando-se os primers Tol2 4 5 F 5′– ATA GCT GAA GCT GCT CTG ATC – 3′ e Tol2 4 5 R 5′ – TCT AAT ATG CTT CCT TAG G – 3′, Tol2 5 f 5’ – CTG CTC TGA TCA TGA AAC AG – 3’ e Tol2 5 5’ – CTT CCT TAG GTT TGA TGG CG – 3’ (Kawakami & Shima, 1999). As sondas continham cópias de DNA Tol2 com 200 pb. A sonda amplificada com os primers Tol2 4 foi marcada biotina-14-dATP e a sonda com Tol2 5 com com digoxigenina-11-dUTP, ambas através de nick translation (DIG – e Biotin – Nick TranslationMix, Roche) seguindo as recomendações do fabricante (Roche, Mannheim, Alemanha).

As soluções de hibridização consistiram de 240 µl de formamida 50%, 96 µl de sulfato dextrano 50%, 48 µl de 20XSSC, 80 µl de água q.s.p., perfazendo um volume total de 480 µl, sendo adicionado 1,5 µg de sonda (DNA marcado com biotina ou digoxigenina). Em seguida, a solução de hibridização foi transferida para um banho a 100 ºC, durante 10 minutos, para desnaturação do DNA e, imediatamente após, para um recipiente com gelo, impedindo a renaturação por choque térmico.

As lâminas, contendo as preparações cromossômicas, foram lavadas com tampão PBS 1X por 5 minutos à temperatura ambiente, sob agitação e, posteriormente desidratadas em séries alcoólicas (70%, 80% e 100%) à frio. Em seguida, foram colocadas em RNAse (RNAse 0,4%/2X SSC) por 1 hora e 30 minutos, em câmara úmida a 37 °C. Após este período as lâminas foram lavadas em soluções salinas (0,005% em HCl 10 mM) a 37 ºC por 10 minutos e fixadas em formaldeído 1% a temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida o material foi desidratado em uma série alcoólica (70%, 80% e 100%), 5 minutos em cada banho, e tratado com formamida 70%/2X SSC a 70 °C, por 5 minutos, para desnaturação dos cromossomos. Uma nova desidratação em série alcoólica foi realizada, sendo posteriormente aplicados sobre a lâmina, 60 µl da solução de hibridização contendo a sonda desnaturada, permanecendo overnight a 37 oC em câmara úmida.

Transcorrido o período, as lâminas foram lavadas em solução de formamida 15% 0,2X SSC a 42oC por 10 minutos, três vezes em 0,1X SSC a 60 °C, 5 minutos em cada lavagem, e em solução Tween 20 (0,05%/2X SSC), sob agitação, por 5 minutos. Foi realizado um tratamento com 100 ml de NFDM 5% (non fat dry milk – leite em pó desnatado) em 4X SSC, por 15 minutos à temperatura ambiente. As detecções das sondas foram feitas, colocando-se sobre as lâminas, 90 µl de avidina-FITC (fluoresceína isotil cianato-avidina conjugada) em NFDM 5% a 0,25 µg/µl ou anti-digoxigenina rodamina/NFDM 5%, por 30 minutos a 1 hora, em câmara úmida a temperatura ambiente, com três lavagens sucessivas com Tween 20, durante 5 minutos em cada lavagem.

O sinal de hibridização foi amplificado com cerca de 70 µl de anti- avidina biotina-conjugada, por 30 minutos, havendo posteriormente três lavagens scuessivas com Tween 20 (0,5%/4X SSC), durante 5 minutos em cada lavagem. O sinal de hibridização da avidina-FITC foi amplificado com 90 µl de anti-avidina biotina conjugada em NFDM 5% por 30 minutos, com três lavagens adicionais com Tween 20 (5 minutos por lavagem). Este ciclo e o tratamento com FITC foram repetidos mais duas vezes. Para a detecção das sondas marcadas com digoxigenina, foi utilizada anti-digoxigenina rodamina conjugada em NFDM 5%. As lavagens com Tween 20 foram as mesmas para avidina-FITC. Finalmente as lâminas foram desidratadas em série alcoólica (70%, 80% e 100%), durante 5 minutos em cada banho. Os cromossomos foram contra-corados com Vectashield/DAPI (1,5 µg/ml) (Vector) e as lâminas foram analisadas utilizando-se os filtros microscópicos de fluorescência apropriados.

3.2.4.5 Revelação de regiões de DNA metiladas

Padrões de metilação do DNA nos cromossomos metafásicos foram avaliados pela análise da ligação de anticorpo monoclonal a 5-methylcytosine (5mC). A imunodetecção indireta do DNA metilado foi realizada de acordo com Marques et al. (2011). As lâminas foram tratadas com RNAse (Invitrogen) 20 mg/ml diluída em 1:200 em 2XSSC por uma hora, seguida a exposição por pepsina 1 mg/ml (1:100) em 0,01N HCl (100 μl por lâmina) por

20 minutos. Seguiu-se a desnaturação do DNA em formamida 70% por 3 minutos a 75 ºC sendo posteriormente bloqueado com 3% de BSA diluído em 1X PBS, 0,1% Tween 20, por 30 min à 37°C e incubado com anticorpo primário mouse-anti-5-methylcytosine (Eurogentec™) em 1% BSA/1X PBS (1:100) overnight à 4°C.

A detecção da 5mC foi feita utilizando anti-mouse-FITC diluído (1:200) em 1% BSA/1X PBS por 1h à 37° C. Por fim, as lâminas foram lavadas em 1X PBS, montadas com DAPI/Vectashield antifading (Vector Laboratories™) e analisadas em microscopia de fluorescência através de um fotomicroscópio Leica DMBL (©Leica Microsystems) equipado com uma câmera CCD Cohu (CohuHD Costar™), utilizando o software QFISH (©Leica Microsystems). A composição da imagem com os sinais de hibridização foi realizada no programa Photoshop CS5(Adobe™).