Param`etres d’acquisition des images

Nous avons utilis´e, pour l’acquisition des images, un microscope confocal ZeissLSM [Laser Scanning Microscope.] 410 illustr´e figure 2.17.

En ce qui concerne la longueur d’onde du laser, nous avons choisi 543nmcar c’est la longueur d’onde qui permet d’observer au mieux la plaque par r´eflexion (le miroir dichro¨ıque du microscope est `a la fois transparent et r´efl´echissant pour cette longueur d’onde).

Pour obtenir un bon compromis entre le grossissement et la luminosit´e de l’image, nous avons choisi un objectif sec (n= 1), dont legrossissement est 20×et l’ouverture num´eriquede 0.75.

Fig. 2.17 – Microscope Zeiss Axiovert 410

Les ouvertures du pinhole inf´erieures `a 1AU donnent des images qui ne sont pas assez lumineuses. Nous avons donc choisi des tailles de pinhole t_P >1AU.

Si l’on r´ecapitule :

– λ= 543nm (soit 0.543µm) – n= 1

– O.N.= 0.75 – t_P >1U A

D’apr`es les ´equations donn´ees dans le tableau 2.2, on obtient les r´esolutions voxelliques optimales suivantes :

– r´esolution lat´erale :

d_XY <0.255 λ

ON soitd_XY <0.2µm – r´esolution axiale :

d_Z < 0.44 λ n−√

n²−ON² soitd_Z <0.7µm

Ces r´esolutions optimales th´eoriques correspondent aux limites physiques du microscope confocal. Cependant, ces valeurs sont bien au-del`a de la pr´eci-sion n´ecessaire pour observer des micro-vaisseaux. En effet, les plus petits capillaires que nous souhaitons observer ont un diam`etre d’environ 3µm.

D’apr`es le th´eor`eme de Nyquist-Shannon (cf. section 2.3.4), des voxels dont la r´esolution (d_XY, d_XY, d_Z)<(1.5µm×1.5µm×1.5µm) sont suffisants pour imager des vaisseaux de 3µm.

En ce qui concerne la r´esolution lat´erale, une coupe correspondant `a un plan focal du microscope couvre, avec l’objectif et le zoom choisis, une portion de 640×640µm² du cortex c´er´ebral. Le constructeur du microscope propose 3 r´esolutions possibles pour une telle coupe :

– soit les coupes ont une r´esolution de 2.50µm×2.50µmpour une taille de 255×255 pixels,

– soit les coupes ont une r´esolution de 1.25µm×1.25µmpour une taille de 512×512 pixels,

2.4. PROTOCOLE D’ACQUISITION DES IMAGES 41 – soit les coupes ont une r´esolution de 0.625µm ×0.625µm pour une

taille de 1024×1024 pixels.

Les deux derni`eres r´esolutions correspondent aux exigences du th´eor`eme de Nyquist-Shannon. Cependant, comme nous le verrons dans la sections sui-vante, pour obtenir une couverture suffisante du cortex, le volume d’images doit ˆetre tr`es important. Or une r´esolution lat´erale de 0.625µm×0.625µm n’est pas indispensable pour nos observations et consomme beaucoup de m´e-moire. De plus, comme nous verrons plus tard, les temps d’acquisition des images tr`es d´etaill´ees peuvent ˆetre un facteur limitant pour l’acquisition. La r´esolution qui r´epond au mieux `a nos attentes est la r´esolution interm´ediaire de 1.25µm×1.25µm par voxel.

Afin d’observer les effets de la r´esolution axiale et de l’ouverture du pinholesur nos images, nous avons effectu´e trois s´eries d’acquisition couvrant chacune une zone plus ou moins vascularis´ee du cerveau. Pour chaque s´erie, nous avons fait varier la taille du pinhole avec des valeurs de 1, 1.5 et 2 U A. Nous avons aussi test´e pour chaque s´erie deux valeurs extrˆemes de la r´esolution axiale : 0.6µm et 3µm.

Le meilleur compromis semble ˆetre un pinhole de 1 UA : les vaisseaux sont beaucoup plus nets et la luminosit´e reste convenable.

Les anneaux de Newton sont beaucoup plus marqu´es sur les images dont la r´esolution est tr`es haute (0,6µm) et s’estompent pour une r´esolution inf´erieure (3µm).

On observe aussi des probl`emes “d’ombre” des gros vaisseaux dans les images `a faible r´esolution. En effet, dans ces images, lorsque l’on a de gros vaisseaux sur le dessus de l’image, les petits vaisseaux situ´es au-dessous de ces gros vaisseaux ne sont pas visibles (cf. figure 2.18). En fait, comme le

Fig. 2.18 – Lorsque la r´esolution axiale est trop faible, les petits vaisseaux situ´es au dessous d’un gros vaisseaux ne sont pas visibles.

th´eor`eme de Niquyst-Shannon n’est pas respect´e, les petits vaisseaux sont mal ´echantillonn´es et n’apparaissent que tr`es faiblement dans l’image. Cet effet “d’ombre” n’existe plus avec r´esolution convenable (i.e. qui r´epond au crit`ere de Nyquist-Shannon).

Un autre param`etre important est le temps d’acquisition des images. En effet, un volume d’images acquis avec une r´esolution axiale de 3µm com-porte 100 coupes et est acquise en 3 minutes. Un volume d’images avec une r´esolution axiale est de 0.6µm comporte 500 coupes et est acquise en 20 minutes. Ce temps d’acquisition est un facteur limitant important dans le processus d’acquisition des images : pour couvrir une large partie du cerveau, on acquiert beaucoup d’images. En effet, acqu´erir une centaine d’images qui demandent 20 minutes d’acquisition chacune peut poser des probl`emes lo-gistiques importants.

Un bon compromis entre le temps d’acquisition, le volume de donn´ees et la pr´ecision souhait´ee est une r´esolution lat´erale de 1.25µmet une r´esolution axiale de 1.4µm(qui est l´eg`erement plus pr´ecise que la r´esolution de 1.5µm impos´ee par le th´eor`eme de Nyquist-Shannon).

Diff´erentes s´eries d’acquisition ont ´et´e effectu´ees. Certaines, notamment, nous sont parvenues avant les diff´erents tests sur la r´esolution, et compte tenu du temps d’acquisition ´elev´e, ont ´et´e acquises avec une r´esolution axiale de 3µm.

Enfin les coupes ont une ´epaisseur comprise entre 300 et 400µm, mais l’on constate, quelle que soit la r´esolution, qu’apr`es 150µm d’´epaisseur, la lumi`ere a du mal `a passer et `a ˆetre r´efl´echie. Le rapport signal sur bruit devient alors trop faible et l’on ne distingue plus les vaisseaux. On exploitera donc uniquement les coupes situ´ees entre 0 et 150µm.