Param`etres d’acquisition des images

Estase cariotípica em Haemulidae (Teleostei, Perciformes): Evidências de manutenção evolutiva sintênica

Clóvis C. Motta-Neto1*, Gideão W.W.F. Costa1, Karlla D.J. Amorim1, Marcelo B. Cioffi2, Luiz A.C. Bertollo2, Roberto F. Artoni3, Wagner F. Molina1

1_{Centro de Biociências, Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Federal} do Rio Grande do Norte, Natal, Brasil.

2 _{Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos, São Paulo,} Brasil.

3 _{Departamento de Biologia Molecular e Estrutral, Universidade Estadual de Ponta Grossa,} Ponta Grossa, Paraná, Brasil.

*Autor correspondente:

Clóvis C. Motta-Neto - Departmento de Biologia Celular e Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Norte. E-mail: [email protected]

Resumo

A conservação cariotípica em alguns grupos de peixes da Ordem Perciformes é reconhecidamente um exemplo de estase cariotípica. Haemulidae, cujos representantes são conhecidos como “roncadores”, é uma das famílias em que esta condição é largamente difundida. Suas espécies possuem cariótipos 2n=48a, RONs simples e heterocromatina caracteristicamente reduzida e pericentromérica. Os gêneros Anisotremus e Haemulon, o último o mais diverso da família, são amplamente distribuídos no Atlântico Ocidental e cujas informações citogenéticas ainda são limitadas. A ampliação dos dados citogenéticos de suas espécies permitem análises mais detalhadas sobre a extensão e evolução do conservadorismo cromossômico em Perciformes. Aqui são apresentados dados citogenéticos das espécies Anisotremus moricandi, A. surinamensis, populações de A. virginicus e H. chrysargyreum (Brasil e Caribe), Haemulon flavolineatum, H. melanurum, H. parra e H. squamipinna obtidos através de técnicas convencionais (Giemsa, bandamento C e Ag-RON, coloração com fluorocromos DAPI e CMA3) e de

double-FISH com sondas DNAr 5S e 18S. Todas as espécies apresentaram 2n=48a, indicando conservadorismo numérico e estrutural dos cromossomos. Adicionalmente, comparações filogenéticas da organização e localização das sequências ribossomais com espécies de outros gêneros reforçam a manutenção de acentuadas homeologias cromossômicas intra- e cogenéricas, indicando a manutenção evolutiva de extenso conteúdo sintênico nesta família. Por outro lado, divergências pontuais, como co- localização dos genes RNAr 18S/5S ocorrem pontualmente durante a história evolutiva desses gêneros. O conservadorismo cariotípico presente em Haemulidae mantém-se mesmo diante dos processos de diversificação da família. Fatores bióticos e abióticos, como grandes contingentes populacionais e ausência de barreiras físicas e ecológicas ao fluxo gênico, aliados a peculiaridades intrínsecas da arquitetura cariotípica desse grupo de peixes, podem estar envolvidos na inércia evolutiva de seus cromossomos.

Palavras-chave: Haemulidae, estase cariotípica, evolução cromossômica, double FISH.

Abstract

The Karyotypic conservatism in some fish groups of the Perciformes Order is a recognizedly example of karyotypic stasis. Haemulidae, whose representatives are known as "grunts", is one of the families in which this condition is widespread. Its species have karyotypes 2n = 48a, single NORs and heterochromatin characteristically reduced and pericentromeric. The genera Anisotremus and Haemulon, the last being most diverse of the family, are widely distributed in the Western Atlantic and whose cytogenetic informations are still limited. The enlargement of the cytogenetic data of its species allows more detailed analyzes on the extent and evolution of chromosome conservatism in Perciformes. Here we present cytogenetic data of the species Anisotremus moricandi, A. surinamensis, populations of A. virginicus and H. chrysargyreum (Brazil and the Caribbean), Haemulon flavolineatum, H. melanurum, H. parra and H. squamipinna obtained through conventional techniques (Giemsa, C-banding and Ag-NORs, staining with the fluorochromes DAPI and CMA3) and double-FISH with 5S and 18S rDNA probes. All species presented 2n = 48a, indicating numerical and structural conservatism of the chromosomes. Additionally, phylogenetic comparisons of the organization and location of ribosomal sequences with species of other genera reinforce the maintenance of accentuated intra- and cogeneric chromosomal homeologies, indicating the evolutionary maintenance of extensive syntenic content in this family. On the other hand, point divergences such as co-localization of 18S/5S RNAr genes occur punctually during the evolutionary history of these genera. The karyotypic conservatism present in Haemulidae is maintained even in the face of family diversification processes. Biotic and abiotic factors, such as large populations and absence of physical and ecological barriers to gene flow, allied to the intrinsic peculiarities of the karyotype architecture of this group of fish, may be involved in the evolutionary inertia of their chromosomes.

Key words: Haemulidae, karyotype stasis, chromosomal evolution, double FISH.

Introdução

Estase cariotípica é largamente difundida em alguns grupos de Perciformes (Molina, 2007) que demonstram pequena divergência cariotípica durante a divergência filética. Essa condição é pode ser encontrada em diversos organismos e se caracteriza pela ausência de mudanças no número cromossômico (estase cromossômica), na composição e estrutura genômica ou nos níveis de ploidia (Kahl, 2015). A estase cariotípica ocorre em grupos

tão diversos como plantas vasculares (Bomfleur, 2014) e plantas herbáceas (Mandáková et al., 2010; Samad et al., 2016); anfíbios (Aprea et al., 2004; Sessions & Kezer, 1991); aves (Ellegren, 2010) e peixes (Galetti et al., 2000; Molina & Bacurau; 2006; Motta-Neto et al., 2011a, b; Molina et al. 2013; Costa et al., 2016).

A Ordem Perciformes é a maior dentre os vertebrados com 2.248 espécies e consequentemente a mais diversa entre os peixes (Nelson et al., 2016). Nesta Ordem, a subordem Percoidei abriga a maior parte das espécies (2095 espécies). Dados citogenéticos nesta subordem indicam que aproximadamente 40% das espécies analisadas (Arai, 2011), compartilham um cariótipo basal com 2n=48a. Outras características destes cariótipos são heterocromatina geralmente reduzida e encontrada preferencialmente na região centromérica dos cromossomos, além da presença de sítios simples de regiões organizadoras de nucléolos (RONs) (Mandrioli, 2000; Affonso et al., 2001; Ene, 2003; Molina, 2007; Motta-Neto et al., 2011b; Molina et al., 2013).

Entre os Percoidei, as espécies da família Haemulidae apresentam elevado nível de compartilhamento de cariótipos com essas características (Motta-Neto et al., 2011a, b). A ampliação dos dados citogenéticos para outras espécies e populações desta família propiciam uma condição apropriada para a análise da manutenção sintênica da arquitetura cromossômica nesta subordem. Diante disso, aqui são apresentados dados citogenéticos de oito espécies e duas populações dos gêneros Anisotremus e Haemulon (Haemulinae) do Caribe e da costa do Brasil, obtidos através de técnicas de citogenética convencional (coloração com Giemsa, AgRONs, bandamento C, e coloração com os fluorocromos base-específicos CMA3 e

DAPI), além do mapeamento de sequências DNAr 5S e 18S, afim de verificar se este fenômeno está difundido a nível macro ou microestrutural na família Haemulidae.

Material e Métodos

Espécimes e Preparações Cromossômicas

Exemplares da família Haemulidae foram coletados no litoral brasileiro e em Key Largo, na Flórida (EUA) (Figura 5, tabela 1).

Após as coletas, os exemplares foram acondicionados em sacos plásticos contendo água do mar, com oxigenação e mantidos em aquários. Os exemplares foram submetidos à estimulação mitótica “in vivo” de acordo com Molina et al. (2010). Os cromossomos mitóticos foram obtidos a partir de

Espécies N (total) Localidades

Anisotremus moricandi (Ranzani, 1842) 01 Nísia Floresta, RN - 6º01’03,42”S, 35º06’31,13”O (BU, n=1) A. surinamensis (Bloch, 1791) 03 Nísia Floresta, RN - 6º01’03,42”S, 35º06’31,13”O (BU, n=2) Touros, RN - 5º13’11,97”S, 35º25’3,82”O (CA, n=1) A. virginicus (Linnaeus, 1758) 09

Key Largo, EUA - 25º09’40,07”N, 80º45'’83,07”O (KL, n=3) Touros, RN - 5º13’11,97”S, 35º25’3,82”O (CA, n=1) Extremoz, RN - 5º69’90,62”S, 35º19’28,63”O (SR, n=5) H. chrysargyreum Günther, 1859 08

Key Largo, EUA - 25º09’40,07”N, 80º45'’83,07”O (KL, n=3)

Fernando de Noronha, PE - 3º83’97,52”S, 32º41’65,90”O (FN, n=4)

Atol das Rocas, RN -

3º86’44,53”S,33º81’23,49”O (RA, n=1) H. flavolineatum (Desmarest, 1823) 11 Key Largo, EUA - 25º09’40,07”N,

80º45'’83,07”O (KL, n=11)

H. melanurum (Linnaeus, 1758) 02 Key Largo, EUA - 25º09’40,07”N, 80º45'’83,07”O (KL, n=2) H. parra (Desmarest, 1823) 07 Extremoz, RN - 5º69’90,62”S, 35º19’28,63”O (SR, n=2) Fernando de Noronha, PE - 3º83’97,52”S, 32º41’65,90”O (FN, n=4) Nísia Floresta, RN - 6º01’03,42”S, 35º06’31,13”O (BU, n=1)

H. squamipinna Rocha & Rosa, 1999 07

Extremoz, RN - 5º69’90,62”S, 35º19’28,63”O (SR, n=6)

Touros, RN - 5º13’11,97”S, 35º25’3,82”O (CA, n=1)

células do rim anterior, seguindo a metodologia desenvolvida por Gold et al. (1990). As regiões organizadoras de nucléolos e regiões heterocromáticas foram analisadas através das técnicas de Ag-RONs (Howell & Black, 1980), bandamento C (Sumner,1972), e adicionalmente pela coloração com os fluorocromos base-específicos CMA3/DAPI (Schweizer,1980). As amostras

foram coletadas com autorização do Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade (ICMBIO/SISBIO) (Licença número 02001.001902/06-82) e os procedimentos experimentais seguiram todas as normas do Comitê de Ética no uso de Animais da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (protocolo 044/2015).

Os marcadores ribossomais foram isoladas do genoma da espécie Rachycentrum canadum (Euteleostei, Perciformes) e amplificadas utilizando- se os primers A 5’-TAC GCC CGA TCT CGT CG ATC-3’e B 5’-CGA GCT GGT ATG GCC GTA AGC-3’ (Pendás et al., 1994). A sonda DNAr 5S incluiu 200 pares de bases (bp) do gene RNAr 5S e a de DNAr 18S corresponderam a um segmento de 1400 bp do gene RNAr 18S, obtido via PCR do DNA nuclear (Costa, 2015). O mapeamento físico das subunidades ribossômicas DNAr 5S e 18S foi realizado por meio de hibridização in situ (Pinkel et al., 1986). As sondas de DNAr 5S foram marcadas através de nick translation com biotina-14-dATP (Roche, Mannheim, Alemanha), e as DNAr 18S com digoxigenina-11-dUTP (Roche, Mannheim, Alemanha), de acordo com as especificações do fabricante. Para o DNAr 5S (Biotina – Nick TranslationMix, Roche), DNAr 18S (Digoxigenina – Nick TranslationMix, Roche).

Aproximadamente trinta metáfases de cada espécime foram fotografadas utilizando-se o fotomicroscópio de epifluorescência OlympusTM BX50, sob aumento de 1000X, equipado com sistema de captura digital (Olympus DP-73) através do software cellSensÒ OlympusTM _{e utilizadas na}

confecção dos cariótipos. Os cromossomos foram classificados em relação a posição do centrômero (Levan et al., 1964) e organizados em ordem decrescente de tamanho.

Resultados

Todas as espécies apresentaram valor diplóides de 48 cromossomos acrocêntricos (NF=48). Os cariótipos apresentaram simétricos com pequena variação de tamanho entre os maiores e os menores pares cromossômicos. Em algumas espécies foi possível observar a presença de constrições secundárias em alguns pares cromossômicos. Em A. virginicus (Figura 6) e H. squamipinna (Figura 7) essas constrições se localizam no 24º par e em H. squamipinna a localização se dá no 5º par cromossômico. Os sítios Ag-RONs estam localizados em um único par cromossômico, de forma destacada no braço curto do 24º par, excetuando-se as espécies H. chrysargyreum, no 5º par em posição subterminal e H. melanurum, no 10º par em posição pericentromérica do braço longo (Figura 7).

As espécies apresentaram um baixo conteúdo heterocromático principalmente localizado nas regiões centroméricas e com destaque nas regiões organizadoras de nucléolos. Adicionalmente, foram realizadas colorações com fluorocromos base-específicos, que evidenciaram em todos os casos regiões mais coradas nos pares organizadores de nucléolos. Dados com essa metodologia não foram obtidos momentaneamente para A. surinamensis, A. moricandi e H. squamipinna (Figuras 6 e 7).

Os sítios de DNAr 5S estavam localizados em posição terminal no braço curto do 10o par na maioria das espécies (Figuras 6 e 7), excetuando- se A. virginicus onde ocupava a região terminal do braço longo do 5º par, enquanto que em A. moricandi se localizava no braço curto do 24o par (Figura 6). As regiões DNAr 18S foram coincidentes com os sítios Ag-RONs. Divergências de localização foram observadas no cariótipo de H. chrysargyreum, onde se situavam em posição subterminal no 5o par e em H. melanurum, onde estas regiões estavam localizadas no braço curto do 10o

par (Figura 7).

Sintenias marcantes foram verificadas intra e intergenericamente, principalmente com relação a localização dos pares RONs, sítios DNAr 5S e DNAr 18S. Durante as análises, não se indentificou nenhuma variação estrutural dos cromossomos ou da organização dos genes ribossomais entre as populações da costa brasileira e do Caribe.

Figura 6. Cariótipos das espécies de Anisotremus através de coloração convencional com Giemsa (esquerda), bandamento C (centro) e hibridização in situ com sondas DNAr 5S e 18S (direita). Em destaque os pares organizadores nucleolares evidenciando sítios Ag-RONs, bandas- C e padrões de coloração com os fluorocromos DAPI/CMA3, sítios DNAr 5S e 18S. Barra = 5µm. .

Figura 7. Cariótipos das espécies de Haemulon através de coloração convencional com Giemsa (esquerda), bandamento C (centro) e hibridização in situ com sondas DNAr 18 e 5S (direita). Em destaque os pares organizadores nucleolares evidenciando sítios Ag-RONs, bandas-C e padrões de coloração com os fluorocromos DAPI/CMA3, sítios DNAr 5S e 18S. Barra = 5µm.

Discussão

As oito espécies de Haemulidae apresentaram características similares quanto ao número e estrutura cariotípica. Esse conjunto, caracteristicamente formado por 2n=48a, sítios Ag-RONs simples e heterocromatina pericentromérica reduzida é considerado plesiomórfico entre os Percomorpha (Galetti et al., 2000; Molina, 2007).

O mapeamento dos sítios DNAr 18S indicou sua localização ao longo da diversificação filética principalmente mantida no menor par cromossômico (par 24), exceto em H. chrysargyreum, onde ocupa a porção terminal do braço longo do 5o _{par. Embora 18S em outras espécies possa constituir}

valiosos marcadores citotaxonômicos, diante da recorrência de alguns padrões o seu uso se mostra restrito em Haemulidae.

Os sítios DNAr 5S se mostram mais variáveis evolutivamente, localizando-se em um ou dois pares cromossômicos, mas também revelam regularidade de número e posição em cromossomos homeólogos. Frequentemente apresentam-se não sintênicos com o DNAr 18S, exceto em A. moricandi, a qual apresenta uma organização co-localizada.

O conservadorismo cariotípico, que pelos dados obtidos para Haemulidae podem se estender também para aspectos da organização dos seus genes, está presente em diversos grupos de Percomorpha (Galetti et al., 2000, Molina, 2007). As causas e extensão desta condição ainda não são inteiramente compreendidas. Os cariótipos destes grupos se mantem conservados por não possuir as características intrínsecas promotoras de variação ou estão submetidos a forças seletivas que impedem mudanças? Fatores bióticos dos grupos e físicos do ambiente contribuem para essa condição de estase?

A estase evolutiva é ampla e se traduz pela ausência de modificações nos diferentes níveis dos organismos ao longo da sua história evolutiva. Essa condição evolutiva em alguns casos pode se mostrar temporalmente transitória variando quando da ocorrência de fatores disruptivos (Burt, 2001). Em alguns casos caracteriza-se como um padrão determinado pela manutenção de uma característica que persistem por milhões de anos como resultado da seleção estabilizadora (Wake et al.,

1983). Em termos adaptativos, a estase evolutiva pode refletir homeostase do desenvolvimento ou permanência estática em picos adaptativos (Lerner, 1954; Mayr, 1982; Charlesworth et al., 1982; Kirkpatrick, 1982; Templeton 1982; Nanney, 1982).

Em geral é comum igualar estase (padrão) com inércia ou restrição (processo), bem como mudança evolucionária (padrão), com a ação da seleção (processo). Quando o processo evolutivo é considerado adaptativo, a estase é definida pela ação da seleção estabilizadora e flutuações na seleção direcional, enquanto as mudanças evolutivas seriam dirigidas pela seleção direcional ou disruptiva. A estase pode ainda indicar falta de variação genética, ou relações antagônicas entre as características sob seleção (Ackerly, 2016). Esta visão selecionista da estase organismal pode não ser propriamente aplicada à estase cariotípica vivenciada por vários grupos de peixes.

As características cariotípicas refletem o marcado conservadorismo cromossômico dos sítios DNAr 18S em Haemulidae, por outro lado, as sequências DNAr 5S têm um padrão mais dinâmico. A discrepância no nível de diversificação cromossômica dos genes DNAr 18S e 5S em Haemulidae evidencia diferentes taxas evolutivas. De fato, o DNAr 18S representa uma das regiões do DNA nuclear mais estudadas, em grande parte por possuir uma taxa evolutiva muito lenta, possibilitando seu uso na evidenciação de divergências filogenéticas antigas alcançando 400 M.a. Por outro lado gene RNAr 5S já apresenta uma taxa evolutiva mais dinâmica com variações estruturais entre diferentes filos, sendo utilizado para a reconstrução de eventos evolutivos relativamente recentes (Hillis & Dixon, 1991).

Evolutivamente, sítios DNAr 5S apresentam-se em três padrões básicos para Haemulidae. O primeiro, que abrange o maior número de espécies, é a ocorrência de um único sítio na posição pericentromérica do par 10, presente em A. surinamensis, H. flavolineatum, H. parra, H. squamipinna, H. chrysargyreum e H. melanurum, bem como em espécies de gêneros mais basais como Conodon (Figura 8). Um segundo padrão consiste na localização destes sítios no par 5º em posição terminal do braço longo, presente em H. aurolineatum – população da costa brasileira (Motta-Neto et al., 2011b), H. steindachneri (Motta-Neto, 2011b), Haemulopsis

corvinaeformis (Motta-Neto, 2011b) e A. virginicus (Figura 8). Um terceiro, menos comum consiste em dois sítios DNAr 5S nestes dois pares (pares 5 e 10), como em H. plumierii (Motta-Neto et al., 2011b), H. bonariense (Nirchio & Oliveira, 2014), possivelmente presente em H. aurolineatum – população do Caribe (Nirchio et al., 2007), e em Conodon nobilis (Motta-Neto et al., 2011a) (Figura 8).

Figura 8. Relações filogenéticas baseadas em dados moleculares de espécies da família Haemulidae de

diferentes regiões oceânicas. Atlântico Ocidental ( ), Caribe ( ), costa do Brasil ( ) e Pacífico Oriental ( ); informações citogenéticas disponíveis e valores referentes a área de distribuição em km2 sob as barras em cinza no interior da forma geométrica representativa para a distribuição. Adaptado de Bernardi et al., 2008; Rocha et al., 2008; Tavera et al., 2012.

A similaridade na localização e tamanho dos pares cromossômicos portadores dos sítios DNAr 5S e 18S em Haemulidae, indicam que possivelmente correspondam a cromossomos homeólogos. Desta forma, oferecem forte suporte da ocorrência de grupos sintênicos evolutivamente conservados nesta família. A estase cromossômica se estende a

conservação de ordem de genes (Ellegren, 2010), como parecem sugerir as regiões homeólogas dos cromossomos portadores de sítios ribossomais na família Haemulidae.

A presença de pares cromossômicos homeólogos portadores de sítios ribossomais têm sido amplamente identificada em vários grupos de peixes (Martins & Galetti, 1999, 2000; Vicente et al., 2001; Centofante et al., 2002).

A co-localização de sítios DNAr 5S e 18S em A. moricandi (24º par) e em H. melanurum (par 10), indica a ocorrência de condições disruptivas da estabilidade sintênica e se mostram como padrões derivados de organização do DNAr em Haemulidae.

A heterocromatina nos cariótipos das espécies de Haemulidae, embora possa constituir um marcador citotaxonômico importante em alguns grupos de peixes (Lima & Molina, 2004), possui uma distribuição pericentromérica regular em Haemulidae. Dentre as regiões heterocromáticas, apenas aquelas equilocais aos sítios DNAr 18S apresentaram significativo conteúdo GC. Por outro lado, os sítios DNAr 5S, apesar de poderem se apresentar heterocromáticos, só apresentaram resposta positiva aos fluorocromos base-específicos quando estão co- localizados com o DNAr 18S, como evidenciado em H. melanurum.

A tendência que diferentes cariótipos apresentam à ocorrência de certos tipos de rearranjos cromossômicos ao longo de suas trajetórias evolutivas poderia levar à fixação de cariótipos simétricos, apresentando cromossomos com tamanhos aproximados e mesma morfologia (White, 1973; King, 1981), caracterizando processos ortoseletivos, podendo, mediante características intrínsecas do cariótipo moduladas por processos seletivos, apresentar claras conotações evolucionárias (Molina, 2007). Cariótipos similares extensivamente distribuídos em um grupo poderiam ainda ser indicadores de separação relativamente recente, não havendo tempo suficiente na escala evolutiva para a fixação de rearranjos cromossômicos particulares (Sola et al., 1981). Embora algumas espécies do gênero Haemulon tenham sofrido diversificação recente (Near et al., 2013), esta condição parece pouco provável como explicação para a estase

cariotípica presente entre inúmeras famílias marinhas de Percomorpha surgidas no Terciário.

Fatores ambientais e intrínsecos da história de vida das espécies têm sido apontados como interferentes nos padrões cromossômicos de peixes marinhos (Molina & Galetti, 2004; Sena & Molina, 2007). Sem dúvida, os grandes efetivos populacionais das espécies de Haemulidae e suas vastas áreas de distribuição (Figura 8) podem dificultar o estabelecimento de mudanças cariotípicas evolutivas. Neste sentido, barreiras biogeográficas, como a da pluma dos rios Amazonas e Orinoco, estão associadas às divergências cromossômicas entre as populações de H. aurolineatum do Caribe (Nirchio et al., 2007) e as do litoral brasileiro (Motta-Neto et al., 2011b).

Apesar do efeito da barreira do Amazonas na diversificação da fauna do Atlântico, sua participação pode não ser efetiva para muitas espécies de peixes (Rocha, 2003). De fato, as análises populacionais em A. virginicus (Caribe – litoral brasileiro) e H. chrysargyreum (Caribe – ilhas oceânicas do Atlântico Ocidental) não apresentaram qualquer diferenciação cariotípica.

Os padrões citogenômicos presentes em Haemulidae ampliam substancialmente o espectro taxonômico analisado e confirmam o extenso conservadorismo em alguns grupos de Perciformes. Características intrínsecas dos cromossomos deste grupo, aliados a características biológicas e ambientais, parecem agir sinergicamente favorecendo o quadro de estase presente nesta família de peixes marinhos. Nesse sentido, a clarificação dos padrões genéticos pode contribuir para o estabelecimento. Referências Bibliográficas

Arai, R. (2011). Fish Karyotypes: A Check List. Tokyo: Springer.

Ackerly, D.D. (2016). Principles of phylognenetics: ecology and evolution. Integrative Biology 200: 1–8.

Affonso, P.R.A.M., Guedes, W., Pauls, E., Galetti Jr. P.M. (2001). Cytogenetic Analysis of Coral Reef Fishes from Brazil (Families Pomacanthidae and Chaetodontidae). Cytologia 66: 379–384.

Aprea G, Andreone F, Capriglione T, Odierna G, Vences M. (2004). Evidence for a remarkable stasis of chromosome evolution in Malagasy treefrogs (Boophis, Mantellidae). It. Journ.of Zool. 71: 237–244.

Bomfleur, B., McLoughlin, S., Vajda, V. (2014). Fossilized nuclei and chromosomes reveal 180 million years of genomic stasis in royal ferns. Science, 343(6177): 1376–1377. Burt, D.B. (2001). Evolutionary stasis, constraint and other terminology describing

evolutionary patterns. 72(4): 509–517.

Centofante L., Bertollo L.A.C., Moreira-Filho O. (2002). A ZZ/ZW sex chromosome system in anew species of the genus Parodon (Pisces, Parodontidae). Caryologia 55: 139– 150.

Charlesworth, B., Lande, R., Slatkin, M. (1982). A Neo-Darwinian commentary on macroevolution. Evolution, 36(3): 474–498.

Costa, G.W.W.F. (2015). Mapeamento cromossômico de DNAs repetitivos com fins biotecnológicos em peixes marinhos de interesse comercial – Rachycentridae e Lutjanidae. Tese de doutorado, 144 pp.

Costa, G.W.W.F., Cioffi, M.B., Bertollo, L.A.C., Molina, W.F. (2016). The evolutionary dynamics of ribosomal genes, histone H3, and transposable Rex elements in the genome of Atlantic snappers. Journal of Heredity, 107(2): 173–180.

Ellegren, H. (2010). Evolutionary stasis: the stable chromosomes of birds. 25(5): 283–291. Ene, A.C. (2003). Chromosomal polymorphism in the goby Neogobius eurycephalus

(Perciformes: Gobiidae). Marine biology, 142: 583– 588.

Galetti Jr., P.M., Aguilar, C.T., Molina, W.F. (2000). An overview on marine fish cytogenetics. Hydrobiologia. 420: 55–62.

Gold, J.R., Li, C., Shipley, N.S., Powers, P.K. (1990). Improved methods for working with fish chromosomes with a review of metaphase chromosome banding. J. Fish Biol., 37: 563–575.

Hillis, D.M., Dixon, M.T. (1991). Ribosomal DNA: molecular evolution and phylogenetic inference. 66(4): 411–453.

Howell, W.M., Black, D.A. (1980). Controlled silver staining of nucleolus organizer region with protective colloidal developer: a 1st-step method. Experientia 36, 1014–1015.