2.3 Le microscope confocal
2.3.1 Fonctionnement du microscope confocal
D´ecrite pour la premi`ere fois par Marvin Minsky en 1957 [Min88], la technique d’imagerie confocale permet d’obtenir l’image d’un sp´ecimen en trois dimensions. Dans son principe, il ressemble beaucoup `a un microscope conventionnel, `a l’exception d’un diaphragme plac´e devant le photod´etec-teur. Ce diaphragme ´elimine les faisceaux de lumi`ere provenant des plans situ´es au-dessus et au-dessous du plan focal. En effet, l’une des limitations de la microscopie conventionnelle est la trop grande profondeur de champ de l’image. La zone de mise au point apparaˆıt nette, mais les zones imm´edia-tement au-dessus et en-dessous sont floues et perturbent l’image observ´ee.
De plus, un microscope conventionnel acquiert parall`element tous les points du sp´ecimen, alors qu’un microscope confocal acquiert l’image du sp´ecimen par balayage, c’est-`a-dire point par point. La figure 2.5 repr´esente le sch´ema optique du microscope confocal : un rayon lumineux ´emis par le laser vient
´eclairer un point du sp´ecimen dans le plan focal de l’objectif, apr`es avoir ´et´e dirig´e par le miroir dichro¨ıque2. Le rayon r´e´emis (par fluorescence ou par r´eflexion) vient ensuite frapper un photod´etecteur. Le microscope confocal acquiert ainsi un point du sp´ecimen. Pour acqu´erir tout le sp´ecimen, il ef-fectue un balayage ligne `a ligne, puis plan par plan.
Le microscope confocal peut ˆetre utilis´e en fluorescence, ou en simple r´eflexion. La plupart du temps, il est utilis´e en fluorescence. Dans ce cas, le sp´ecimen est trait´e avec un marqueur fluorescent.
2miroir semi-r´efl´echissant.
2.3. LE MICROSCOPE CONFOCAL 25
Fig. 2.5 – Sch´ema optique du microscope confocal.
(a) (b) (c)
Fig. 2.6 – Principe de la microscopie par fluorescence.
La figure 2.6 (a) illustre les 3 phases intervenant lors de la fluorescence.
Dans une premi`ere phase, le laser (de longueur d’onde λex) vient exciter les mol´ecules fluorescentes (aussi appel´ees fluorophores). Ces fluorophores passent de leur ´etat de repos S0 `a un ´etat excit´e S1′ grˆace `a l’´energie hνex fournie par le laser. Une partie de cette ´energie est dissip´ee (sous forme de chaleur ou de r´eactions chimiques) et lors de la deuxi`eme ´etape, les fluo-rophores passent de l’´etat excit´e S1′ `a l’´etat excit´e S1. Enfin, lors d’une troisi`eme ´etape, les fluorophores retournent `a leur ´etat de repos et ´emettent
des photons avec une ´energie hνem ≤ hνex. La longueur d’onde ´etant in-versement proportionnelle `a l’´energie, la longueur d’ondeλem de la lumi`ere r´e´emise est donc plus grande que la longueur d’ondeλex du laser (cf. figure 2.6 (b)). Le miroir dichro¨ıque du microscope confocal permet alors de s´e-parer les rayons incidents des rayons r´e-´emis comme le montre la figure 2.6 (c).
Dans notre cas, le mat´eriel utilis´e ne peut plus ˆetre rendu fluorescent (il est d´ej`a install´e sur une plaque et ne contient pas de fluorophores). On utilise le microscope confocal en mode r´eflexion. On consid`ere que le baume du Canada dans lequel sont plong´ees les coupes, ainsi que le parenchyme du cerveau sont transparents. Ainsi, seule l’encre de Chine dont les vais-seaux sont inject´es r´efl´echit le rayon laser. Le miroir dichro¨ıque est `a la fois transparent et r´efl´echissant pour la longueur d’onde choisie (on a la mˆeme longueur d’onde pour la lumi`ere ´emise et r´efl´echie). L’image ainsi form´ee est constitu´ee d’un signal lumineux important pour les vaisseaux (l`a o`u la lumi`ere a ´et´e r´efl´echie), et faible pour le fond (l`a o`u la lumi`ere n’a pas ´et´e r´efl´echie vers le photo-d´etecteur).
Caract´eristiques d’un microscope confocal
Les principaux ´el´ements caract´eristiques d’un microscope confocal sont son objectif, qui contient un jeu de lentilles et sert `a obtenir une image agrandie du sp´ecimen, et le diaphragme (en anglaispinhole) qui sert `a limiter le flou enz.
L’objectif
L’objectif du microscope contient un jeu de lentilles qui permet de focaliser sur un point du sp´ecimen et d’obtenir une image agrandie de l’objet ob-serv´e (cf. figure 2.7). Ses principales caract´eristiques sont le grossissement et l’ouverture num´erique.
Fig. 2.7 – Quelques exemples d’objectifs.
Indice du milieu (refractive index en anglais), not´e n. La lentille termi-nale peut ˆetre simplement `a l’air, mais pour certains objectifs, cette
2.3. LE MICROSCOPE CONFOCAL 27 lentille est plong´ee dans un milieu d’indice de r´efraction diff´erent (sou-vent de l’huile), ce qui permet d’obtenir des ouvertures num´eriques sup´erieures `a 1.
Ouverture num´erique (numerical aperture en anglais), not´ee ON (ou NA en anglais). Elle d´epend de l’angle maximum (αmax) que peut former un rayon de lumi`ere avec la lentille, et de l’indice (n) du milieu dans lequel est plong´ee la lentille. La figure 2.8 r´esume les grandeurs utilis´ees. L’ouverture num´erique s’exprime de la fa¸con suivante :
Fig. 2.8 – Ouverture num´erique d’un objectif ON =nsin(αmax) =na
d
Grossissement (magnification en anglais). Il d´efinit la grandeur par la-quelle la taille de l’objet va ˆetre multipli´ee au niveau de l’objectif.
La figure 2.9 montre les diff´erentes indications inscrites sur un objectif de microscope.
Le diaphragme
Le diaphragme (pinhole en anglais), du microscope confocal permet d’´eli-miner la contribution lumineuse des plans du sp´ecimen qui ne sont pas di-rectement focalis´es. Plus le diaphragme est ferm´e, et plus l’image est nette, mais moins elle est lumineuse, comme le montre la figure 2.10. L’unit´e de grandeur utilis´ee pour l’ouverture du diaphragme est l’Unit´e d’Airy, not´ee U A (ouAUpourAiryUniten anglais). Elle d´epend de la longueur d’onde λde la lumi`ere incidente et de l’ouverture num´erique de l’appareil. 1UA cor-respond au diam`etre du disque central de la figure de diffraction. Ce disque est d´elimit´e par le premier z´ero de la fonction d’Airy. La figure 2.11 illustre la figure d’Airy sur une plaque dont le diaphragme a une ouverture de 1 UA. L’unit´e d’Airy s’exprime de la fa¸con suivante, en utilisant l’ouverture num´erique de l’objectif (ON) et la longueur d’onde du laser (λ) :
1U A≈1,22 λ
ON (2.1)
Pour plus de d´etails sur le calcul du diam`etre de la tache de diffraction d’Airy, se reporter `a l’annexe A (´equation A.10).
Fig. 2.9 – Caract´eristiques d’un objectif.
(d) diaphragme = 1UA. (e) diaphragme = 2UA. (f) diaphragme ouvert.
Fig.2.10 – Plus le pinhole est ferm´e, plus l’image est nette, mais moins elle est lumineuse.