Fonctionnement du microscope confocal

determinação da variabilidade genética e biodiversidade com elevados níveis de acurácia de reprodutibilidade (Arif & Khan, 2009). Eles são capazes de fornecer informações sobre variações alélicas em determinados locus (Schlötterer, 2004). Nos últimos 30 anos a tecnologia dos marcadores moleculares tem nos permitido estudar uma vasta gama de elementos associada a descoberta genes, respondendo a diversas questões biológicas como o mapeamento de genes em populações, estudos evolucionários, reconstruções filogenéticas, diversidade genética, genética da conservação, além de testes de paternidade e aplicações forenses (Maheswaran, 2004; Schlötterer, 2004; Frankham et al., 2002). Essencialmente, os marcadores moleculares desenvolvidos até então são variantes de três categorias básicas de marcadores genéticos: variantes de proteína (alozimas), variações em repetições de sequências de DNA (minissatélites, microssatélites) e polimorfismos de sequências de DNA (Restriction Fragment Length Polymorphisms – RFLPs e Amplified fragment length polymorphisms – AFLPs) (Schlötterer, 2004).

Os primeiros marcadores moleculares reais estabelecidos foram as alozimas (variações alélicas de enzimas), variantes de proteína em enzimas que podiam ser distintas em gel de eletroforese de acordo com diferenças de tamanho e carga causados por substituições de aminoácidos (Schlötterer, 2004). Os primeiros estudos em Drosophila que demonstraram quantidades elevadas de polimorfismos intrapopulacionais permitiram a elucidação da teoria neutra da evolução molecular (Huby & Lewontin, 1966; Harris, 1966; Lewontin & Hubby, 1966; Jhonsson et al., 1966; Kimura, 1968; King & Jukes, 1969). A utlilzação dessa tecnologia serviu de base para a elaboração dos primeiros mapas genéticos baseados em dados de DNA (Kerem et al., 1989) e estudos populacionais e biogeográficos utilizando-se análises de DNA mitocondrial e ribossomal (Avise, 1994).

A primeira metade da década de noventa foi marcada pela segunda geração de marcadores que revolucionaram o campo da genética molecular, sendo de maior impacto a utilização dos minis e microssatélites – sequências

de di, tri, tetra e pentanucleotídeos repetidos em tandem dispersas nos genomas de todos os organismos eucarióticos, tanto em regiões codantes como nas não codantes, que frequentemente demonstram o comprimento do polimorfismo advindo de crossing over desigual ou conversão gênica (Jeffreys et al., 1999).

Os microssatélites foram os primeiros marcadores a utilizarem efetivamente a tecnologia de PCR, sendo difundida sua grande amplificabilidade por tal técnica (Lit & Luty., 1989; Weber & May, 1989; Schlötterer, 2004). Exemplos da utilização desses marcadores podem ser encotrados em estudos de conservação e manuseio da águia harpia selvagem (Harpia harpyja) (Banhos, et al., 2008), diversidade genética do peixe extremamente ameaçado arowana asiática (Scleropages formosus) (Yue et al., 2004) e do camarão black tiger (Penaeus monodon) (Li et al., 2007).

Uma terceira geração de marcadores moleculares foi desenvolvida durante a segunda metade da década de noventa, cujos os principais foram os RAPDs (Randomly Amplfiied Polymorphic DNA), e AFLPs (Fragment Length Polymorphisms) (Zabeau & Vos, 1993; Vos et al., 1995; Maheswaran, 2004). A principal vantagem dos mesmos é que não necessitam a priori de conhecimentos direcionados ao primer nas espécies alvo (Schlötterer, 2004). RAPDs utlizam um único primer (8-10pb), que se liga a ambas as fitas de DNA a baixas temperaturas de anelamento e aumentam a similaridade de múltiplas regiões amplificantes, representando um locus particular – multilocus (Arif & Khan, 2009). Esse marcador já foi utilizado em estudos de diversidade genética de peixes marinhos dos gêneros Stegastes (Dias Jr. et al., 2007) e Abudefduf (Rodrigues & Molina, 2007) e também para a identificação de populações ameçadas do lagostin de água doce Austropotamobius pallipes (Gouin et al., 2001).

Os AFLPs são marcadores multilocus que envolvem a utilização de enzimas de restrição e amplificação por PCR. Os pontos mais relevantes da técnica são a alta especificidade e reprodutibilidade devido ao uso das enzimas, adaptadores específicos e altas temperaturas de anelamento para a amplificação seletiva (Arif & Khan, 2009). Exemplos do uso desse marcador podem ser observados em estudos de diversidade e coeficiente de

inbreeding em roedores da espécie Peromyscus polionotus subgriseus (Dasmahapatra et al., 2008), diversidade de tubarões tigre-da-areia (Carcharodon taurus) e do tubarão branco (Carcharodon carcharias) (Zenger et al., 2006).

Atualmente os métodos de high-throughput não tratam de avanços conceituais, mas de aplicações aperfeiçoadas em larga escala dos métodos já existentes. Nesse contexto, os SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) se destacam por poderem ser utilizados em larga escala a um custo moderado (Chen & Sulivan, 2003). Esses marcadores focam numa única posição nucleotídica no genoma, sendo necessário, portanto, o conhecimento prévio a respeito de variação alélica na determinada posição genômica (Schlötterer, 2004).

Amplamente utilizado hoje em dia e apesar de não se caracterizar como um marcador molecular propriamente dito, o sequenciamento de DNA é capaz de caracterizar uma determinada região genômica em múltiplos indivíduos fornecendo as informações genéticas mais resolutivas de uma determinada sequência (Schlötterer, 2004). Atualmente é o método mais seguro para se estimar história demográfica, utilizando-se múltiplas regiões genômicas (Schlötterer, 2004). Dentro da categoria de sequenciamento encontramos algumas variações muito particulares como DNA barcoding, marcadores de regiões controle mitocondriais, marcadores de genes mitocondriais de proteínas codantes e marcadores mitocondriais ribossomais. O DNA Barcoding tem se tornado uma ferramenta acurada, rápida e promissora nos últimos tempos para a identificação de vários taxa, revelando espécies até então não reconhecidas pela ciência (Arif & Khan, 2009, Lima- filho et al., 2015, Souza et al., 2016). O Barcode de DNA animal (600-800 pb), gene mitocondrial da citocromo oxidase I (COI), tem sido proposto como um marcador universal para a quantificação de biodiversidade global, aperfeiçoando a maneira como a humanidade se relaciona a biodiversidade selvagem (Janzen et al., 2005). Exemplos do uso dessa técnica podem ser encontrados na identificação de crustáceos anfípodes (Wit et al., 2006), de subprodutos do pescado as suas espécies respectivas (Kochzius et al., 2010), e espécies de peixes regionais para fins de conservação (Asgharian et al., 2011).

Os genes mitocondriais de proteínas codantes são marcadores poderosos quando se trata de análise de diversidade em níveis categóricos baixos como famílias, gêneros e espécies. O genoma animal contém treze genes de proteínas codantes, sendo amplamente utilizado para análises moleculares – Citocromo b (CytB) (Arif & Khan, 2009). Esse marcador já foi utilizado em estudos de diversidade genética em ciclídeos (Farias et al., 2001), identificação de espécies referentes a indústria do pescado de acordo com regulamentações internacionais (Pepe et al., 2005) e estudos populacionais de manejo e conservação de populações de gorais asiáticos (Nemorhaedus spp.) (Min et al., 2004).

Os marcadores mitocondriais de RNA ribomossomal baseiam-se no fato da mitocôndria dos genomas animais possuírem dois genes de RNAs ribossomais (RNAr), DNAr 12S e 16S. O gene DNAr 12S é altamente conservado e tem sido aplicado na exploração da diversidade genética de níveis taxonômicos superiores, por exemplo, filos, ordens e subordens (Colgan et al., 2000; Wang et al., 2001; Møller & Gravlund, 2003). Por outro lado, o gene DNAr 16S é regularmente usado para estudos de níveis taxonômicosintermediários como famílias e gêneros. Para análises moleculares, esses marcadores são primeiramente amplificados por PCR utilizando-se primers conservados e os amplicons são sequenciados.

Os dados do sequenciametno são então alinhados e comparados através de ferramentas bioinformáticas (Arif & Khan, 2009). Esses marcadores já foram utilizados para se verificar a filogenia de espécies do gênero Epinephelus (Serranidae) e da Ordem Pleuronectiformes (Craig et al., 2001; Pardo, 2005), além das relações de parentesco e status sistemático em quatro genera de arraias no Mediterrâneo e Mar Negro (Turan, 2008).