La présente thèse porte sur Vstm2a, un gène inconnu de la littérature identifié dans nos études préliminaires comme enrichi dans les lignées fibroblastiques à fort potentiel adipogénique. Nous avons tenté de déterminer le rôle que pouvait avoir VSTM2A dans le développement de l’adipocyte in vitro, ainsi que dans
la formation du tissu adipeux in vivo. Cependant, au vu du peu d’information disponible sur VSTM2A, nous
avons également essayé de caractériser la protéine. Par la suite, des études fonctionnelles in vitro ont permis d’étudier l’impact de VSTM2A sur Pparγ2 et le potentiel adipogénique des cellules suite à des expériences de surexpression, de culture avec milieu enrichi et de sous-expression dans des modèles de cellules fibroblastiques et préadipocytaires. En parallèle, des expériences de surexpression de PPARγ2 sur différents types cellulaires ont permis d’étudier le lien entre le potentiel adipogénique de la cellule et l’expression de
Vstm2a. Enfin, nous avons cherché à identifier le mécanisme par lequel VSTM2A agissait pour amplifier le
potentiel adipogénique des cellules, malgré la faible connaissance de la littérature sur cette phase adipogénique.
Identification de VSTM2A comme un facteur hautement enrichi dans les préadipocytes commis
Afin d’identifier de nouveaux marqueurs adipogéniques, des lignées avec des potentiels adipogéniques différents ont été créées, puis une puce à ADN a ensuite été utilisée entre ces clones à faible et fort potentiel adipogénique, au stade prolifératif. Plusieurs gènes ont été communément enrichis dans les lignées à fort potentiel adipogénique, et un gène est ressorti de cette analyse comme étant le plus différenciellement exprimé entre nos lignées. Ce gène inconnu de la littérature et fortement exprimé dans les lignées à fort potentiel adipogénique est Vstm2a. Nous avons noté dans nos premières expériences que l’expression de Vstm2a est fortement corrélée à l’engagement adipeux. En effet, l’induction de l’engagement adipeux par une surexpression de PPARγ2 s’accompagne d’une forte expression de Vstm2a.
VSTM2A est une protéine conservée et exprimée tôt durant le développement d’un adipocyte in vitro et in vivo
Au cours de la différenciation adipocytaire in vitro, nous avons observé que l’expression de VSTM2A est précoce et transitoire dans l’ensemble des modèles cellulaires analysés. De plus, son expression précède toujours l’activation de PPARγ2 et la cascade adipogénique. Vstm2a n’est donc pas une cible de l’activation terminale de Pparγ2, au contraire, leur expression est même corrélée négativement pour cette période. Lors de la formation du tissu adipeux de la souris in vivo, on retrouve les mêmes caractéristiques que précédemment observées in vitro, c’est-à-dire une expression précoce de VSTM2A qui décroît au fur et à
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mesure que l’activation terminale de PPARγ2 et que les gouttelettes lipidiques apparaissent. Ce résultat a également été observé dans des tissus humains en cours de développement adipeux.
Chez l’adulte, VSTM2A est une protéine exprimée dans le tissu adipeux en expansion
L’expression de VSTM2A est faible dans l’ensemble des tissus chez l’adulte, incluant le tissu adipeux. VSTM2A est de façon surprenante très exprimé dans le cerveau. Bien que l’expression de VSTM2A soit faible dans le tissu adipeux adulte, un effet probablement lié à la faible abondance de précurseurs adipeux contre l’ensemble des autres cellules du tissu, nous avons noté des augmentations significatives de l’expression de Vstm2a dans le tissu adipeux de souris adultes. En effet, dans les cas d’obésité sévère comme observé chez les souris ob/ob et db/db, l’expression de Vstm2a est enrichie dans le TAB viscéral issu des animaux obèses comparé aux contrôles. On note aussi un pic d’expression de Vstm2a après quelques semaines de régime riche en graisse, qui correspond à la période de prolifération des précurseurs adipeux répertoriée dans la littérature.
VSTM2A est exprimé par des cellules en périphérie des vaisseaux sanguins et par des cellules exprimant des marqueurs préadipocytaires
Des immunofluorescences sur des coupes de TAB en développement révèlent que les cellules exprimant VSTM2A se retrouvent à proximité de cellules vasculaires (CD31) et murales (αSMA), une caractéristique de précurseurs adipeux développementaux. Chez l’adulte aussi, Vstm2a apparait plus
exprimé dans les précurseurs adipeux comme définis par les marqueurs de surface LIN–, CD29+, CD34+,
SCA1+, PDGFRα+ isolés par FACS après digestion à la collagénase. Ces résultats supportent l’idée que
VSTM2A est un marqueur préadipocytaire, autant in vitro qu’in vivo.
VSTM2A est une glycoprotéine sécrétée par des préadipocytes commis
Comme aucune information n’est connue sur VSTM2A dans la littérature, nous avons inspecté des bases de données bioinformatiques pour analyser sa structure. Nous avons noté la présence d’un peptide signal, de sites de glycosylation et d’acides aminés soufrés. Puis, suite à différentes expériences de surexpression et de traitements pharmacologiques, nous avons pu conclure que VSTM2A est une protéine hautement sécrétée, glycosylée, et pouvant s’assembler en structures quaternaires. De manière endogène, VSTM2A est sécrétée par des cellules à fort potentiel adipogénique comme les 3T3-L1 ou les NIH3t3 surexprimant PPARγ2, ainsi que par le TAB viscéral en développement cultivé ex vivo.
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La surexpression de VSTM2A in vitro favorise la différenciation adipocytaire spontanée et sa sous-expression empêche cette différenciation
La surexpression de VSTM2A dans des cellules fibroblastiques a un impact sur le potentiel adipogénique des cellules après différenciation spontanée. La sous-expression de VSTM2A entraîne un défaut adipogénique fort dans différents modèles de préadipocytes ainsi qu’un défaut de fonctionnement dans des préadipocytes bruns. Ce défaut adipogénique est corrigé suite à la restauration de Pparg2 dans les
cellules ayant perdu VSTM2A.Une corrélation positive s’observe entre l’expression de Vstm2a et celle de
Pparγ2 aussi bien en surexpression qu’en sous-expression. Nous avons étudié de manière intensive l’impact
de la forme sécrétée de VSTM2A sur le potentiel adipogénique de cellules fibroblastiques mais aucun résultat ne s’est avéré concluant. En effet, à aucun moment n’avons-nous été en mesure de démontrer que la forme sécrétée de VSTM2A a un impact direct sur la différenciation de préadipocytes en adipocytes matures in vitro. Nos résultats montrent que, malgré une forte capacité de sécrétion, VSTM2A affecte le processus adipogénique via une action intracellulaire.
VSTM2A contrôle l’engagement adipeux en amplifiant le signal BMP et l’expression de PPARγ2
Suite à des expériences d’immunofluorescence et d’immunoprécipitation, l’hypothèse d’une régulation directe de PPARγ2 a été exclue car VSTM2A n’a en aucun cas été identifié dans le noyau ni même interagissant avec des protéines du processus adipogénique. Nous avons donc exploré les facteurs impliqués dans l’engagement adipeux, et la voie des BMP est ressortie modifiée suite à la perte ou la présence de VSTM2A. Nos études montrent que VSTM2A potentialise l’activation de la voie des BMP, et ce dans plusieurs types cellulaires avec un potentiel adipeux. Ce résultat est observé aussi bien chez les préadipocytes blancs que bruns. De plus, suite à l’ajout de BMP, nous avons noté une correction de l’expression basale de Pparγ2 et du défaut adipogénique causé par la perte de VSTM2A. En somme, nos résultats nous permettent de proposer un modèle dans lequel VSTM2A participe à l’engagement adipeux en amplifiant la réponse aux BMP et l’activation de Pparγ2 (Figure 1).
Figure 1 : Schéma bilan de l’étude « Amplification de l’engagement adipeux par VSTM2A ».
VSTM2A un facteur exprimé et sécrété par les préadipocytes, amplifie l’engagement adipeux des cellules en accentuant le signal des BMP et l’activation de Pparg2. VSTM2A contrôle les étapes précoces du développement d’un adipocyte.
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