Suite à ces travaux, VSTM2A ne demeure plus inconnue, les premières caractéristiques de la protéine ainsi que son rôle dans l’engagement adipeux d’un préadipocyte ayant été soulignés. L’hypothèse de travail a été orientée dans cette direction car ce facteur a été découvert comme enrichi dans les 3T3-L1 fortement adipogéniques, que les données bioinformatiques présentaient ce gène comme spécifique à quelques structures seulement et que son expression diminuait à mesure que le préadipocyte se différenciait en adipocyte in vitro. De nombreuses expériences ont par la suite permis de soutenir et d’affiner cette hypothèse en supportant un rôle de la forme intracellulaire dans l’amplification du potentiel adipogénique des préadipocytes. Ces résultats serviront de base solide pour poursuivre les travaux de recherches visant à définir le rôle de la protéine dans un contexte physiologique. D’autres fonctions pourraient également être associées à cette protéine et mériteraient que nous y portions attention. Tous ces aspects seront discutés ci- dessous.
Dualité Vstm2a-Pparγ2
Nous avons souligné dans ces travaux que l’expression de VSTM2A est enrichie dans les préadipocytes. L’expression de VSTM2A est proportionnelle au potentiel adipeux des cellules in vitro et caractéristique des précurseurs adipeux aussi bien au stade développemental qu’adulte in vivo. Lors de la formation d’une cellule adipeuse, nous retrouvons cette expression précoce de la protéine dans l’ensemble des modèles étudiés, une expression qui précède l’apparition des lipides, en amont de la cascade adipogénique menée par l’activation terminale de Pparγ2 (Figure 2 partie corrélation). Cette donnée confirme le fait que Vstm2a n’est pas une cible directe de Pparγ2 induite en phase terminale de la différenciation adipocytaire. Une corrélation entre l’expression basale de Pparγ2 et celle de Vstm2a est de plus mise en évidence dans plusieurs modèles. Ces éléments nous ont menés à l’hypothèse que VSTM2A pourrait participer à l’activation des étapes précoces de développement d’un adipocyte. Or, suite à des expériences fonctionnelles in vitro, nous avons montré que la surexpression de VSTM2A intracellulaire est associée à une élévation de l’expression basale de Pparγ2, qui se caractérise après différenciation spontanée par un impact sur le potentiel adipeux lui-même. De manière symétrique, la perte de VSTM2A entraine une diminution de l’expression basale de Pparγ2, ainsi que du potentiel adipeux de la cellule après différenciation. Il est de plus possible de corriger le défaut adipogénique dû à la perte de VSTM2A par une correction de l’expression de
Pparγ2. Ces données soutiennent donc un rôle de VSTM2A dans l’expression basale de Pparγ2 et a fortiori
dans le potentiel adipeux des cellules.
De manière intéressante, la surexpression de Pparγ2, qui s’accompagne d’une augmentation du potentiel adipeux des cellules, se caractérise aussi par une induction de l’expression de VSTM2A. Une boucle de rétro-contrôle apparaît donc entre ces deux gènes participant à l’amplification du potentiel adipogénique
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des cellules. À noter que cette boucle n’a pas lieu dans des cellules non adipogéniques. VSTM2A pourrait donc être produit pour maintenir cet état préadipocytaire (Figure 2 partie corrélation positive).
Nos études montrent qu’une relation inverse entre l’expression de Vstm2a et Pparg2 est observée lors des étapes finales de la différenciation adipeuse. Nous notons que l’expression de Vstm2a chute dans la deuxième phase d’adipogenèse, simultanément au début de la différenciation adipocytaire, à l’instant où apparaît l’activation de Pparγ2 et la cascade adipogénique (Figure 2 partie corrélation négative). À ce moment précis, une corrélation négative entre l’expression de Vstm2a et de Pparγ2 se dessine : l’augmentation de l’expression de Pparγ2 lorsque la cellule se développe en adipocyte se caractérise par une réduction de l’expression de Vstm2a.
Figure 2 : Schéma explicitant la dualité de relation existant entre Vstm2a et Pparg2.
L’expression de Vstm2a en cours de différenciation adipeuse est schématisée en bleu et celle de Pparg2 en rouge. Les phases de corrélation positive et négative ainsi que les potentiels liens existants entre Vstm2a et Pparg2 sont également indiqués sur le graphique.
Ces résultats soulèvent donc une certaine dualité entre Vstm2a et Pparγ2 liée à deux stades de formation d’une cellule adipeuse. Une corrélation s’observe entre l’expression de Vstm2a et Pparγ2 à un stade de préadipocyte prolifératif et par contre une corrélation négative est notée pour un adipocyte en formation. Cette dualité peut étonner mais elle se justifie par plusieurs aspects. D’abord, le type cellulaire lui- même : préadipocytes et adipocytes sont des cellules complètement différentes (caractéristiques, morphologie) malgré la rapidité et la continuité du processus adipogénique in vitro. De nombreuses autres protéines font également l’expérience d’une certaine dualité dans ces deux types cellulaires. TGFβ1, par exemple, active la prolifération des cellules précurseurs bien qu’il inhibe le processus adipogénique [805], les WNTs agiraient aussi à la fois comme des activateurs de l’engagement adipeux et comme des inhibiteurs de la différenciation adipogénique [576, 806, 807], et le signal ERK est nécessaire pour initier le processus de différenciation des préadipocytes mais nécessite d’être interrompu pour permettre la maturation de l’adipocyte [808].
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Cette réduction de VSTM2A lors de la différenciation adipocytaire amène ainsi une autre hypothèse qui n’a pas encore été explorée, celle d’un potentiel rôle de VSTM2A dans les étapes tardives de l’adipogenèse, comme par exemple une possible répression. Cette hypothèse pourrait expliquer pourquoi le phénotype de surexpression de VSTM2A n’est pas aussi fort que celui de sous expression.
Pparγ2 lui-même présente une dualité de fonction entre les deux étapes de la différenciation
adipocytaire comme souligné avec des propriétés différentes, à savoir prolifération et détermination dans les stades précoces ou différenciation dans l’activation terminale de cellules adipeuses. Ces caractéristiques impliquent des gènes cibles différents mais aussi des éléments de contrôle différents entre ces deux stades. En effet Chou et collaborateurs [603] soulignent la présence dans le promoteur de Pparγ2 (en position 5’) de cinq petites séquences non codantes hautement conservées se comportant comme des activateurs contrôlant l'expression de Pparγ dans les stades précoces de la détermination adipocytaire uniquement. En effet, ces éléments ne sont pas impliqués dans l'induction spectaculaire de l'expression de PPARγ qui accompagne la différenciation terminale des adipocytes. Ainsi, ces sites activateurs devront être étudiés avec notre plus grand intérêt dans le futur car ils représentent une piste qui pourrait nous aider à explorer le processus par lequel VSTM2A activerait Pparγ2 à travers la voie des BMP.
Enfin, nous savons que l’expression de PPARγ2 n’est pas suffisante pour voir apparaître celle de VSTM2A mais que c’est son action sur l’engagement adipeux qui l’est. Ainsi, il nous resterait à explorer l’expression de VSTM2A dans d’autres modèles de cellules souches comme ceux issus de la moelle osseuse, de tissus placentaires, dentaires, ou ombilical pour lesquels un potentiel adipeux est également répertorié.
La voie des BMP, un mécanisme à approfondir
L’impact de la forme sécrétée de VSTM2A sur l’engagement adipeux a également été exploré mais nous n’avons pas réussi à montrer de rôle pour cette forme. Nos hypothèses sont même plutôt favorables à un rôle de la forme intracellulaire seule car son effet sur le potentiel adipogénique des cellules est similaire à la protéine normale. Cette observation, cumulée à la conclusion précédente qui indiquait un rôle de VSTM2A dans l’expression basale de Pparγ2 et a fortiori dans le potentiel adipeux des cellules, nous amène à explorer la voie des BMP. Nous avons découvert que l’activation de la voie des BMP, qui se traduit par une phosphorylation de SMAD1/5/8, était en jeu puisque la perte ou la surexpression de VSTM2A se répercute sur la réponse de cette voie. Une fois activés, les BMP vont induire l’expression de Pparγ2 entrainant l’engagement adipocytaire de la cellule. Il nous reste encore à identifier chacun des intervenants
intermédiaires dans cette voie. Nous savons déjà qu’il faut privilégier une action au niveauintracellulaire, car
la forme sécrétée de VSTM2A n’est pas impliquée dans l’adipogenèse. Nous savons aussi que VSTM2A ne se retrouve pas dans le noyau cellulaire comme le montre nos résultats d’immunofluorescence, ce qui exclut une régulation directe de PPARγ2 par VSTM2A. Enfin nous savons que la phosphorylation de SMAD1/5/8
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est modulée en accord avec VSTM2A. Afin d’identifier des partenaires moléculaires qui pourraient nous donner des indices sur le mécanisme par lequel VSTM2A affecte la voie des BMP, nous avons fait des co- immunoprécipitations et avons effectué des analyses de spectroscopie de masse. Malheureusement, ces études n’ont pas réussi à démontrer son interaction avec des éléments connus du processus adipeux. Une réitération de ces expériences de co-immunoprécipitation est cependant envisageable car, avec du recul, une amélioration de la technique reste possible. En effet, trouver dans ces résultats la présence de récepteurs BMP ou de protéines SMAD ou toutes autres protéines connues du processus adipeux ou de la modulation de la phosphorylation de SMAD1/5/8 serait un tremplin pour détailler le mécanisme. Au niveau transcriptionnel, aucun des éléments de la voie des BMP n’a paru perturbé (BMPr1a/1b/2, SMAD1/5/9) lors de nos résultats préliminaires réalisés sur les échantillons de 3T3-L1 sous exprimant ou non VSTM2A en sous-confluence. En effet, la perte de VSTM2A dans ces cellules n’affectait pas l’expression de ces éléments de manière significative. Cependant, ce résultat n’exclut pas un contrôle de ces éléments par VSTM2A au niveau traductionnel ou post-traductionnel.
VSTM2A, une protéine inconnue se présentant sous plusieurs formes
VSTM2a est une protéine de 236 acides aminés (aa) qui contient une séquence signal peptide, un domaine immunoglobuline et dont la structure est conservée entre les espèces. Suite à de nombreuses expériences in vitro, la protéine VSTM2A s’est avérée hautement sécrétée, glycosylée et pouvant s’associer sous forme de dimères. La sécrétion endogène de VSTM2A quant à elle suit le profil d’expression, c’est à dire que la quantité de VSTM2A sécrétée est proportionnelle au potentiel adipeux des cellules.
Durant le projet nous avons été confrontés à plusieurs interrogations concernant le poids moléculaire de la protéine par immunobuvardage. Nous avons par exemple observé plusieurs formes intracellulaires en lien avec la maturation de la protéine, et une forme extracellulaire qui migre à un poids moléculaire plus élevé qu’attendu. De plus, dépendamment du type cellulaire dans lequel a lieu la surexpression, la protéine migre à des tailles moléculaires et en quantités différentes. Une observation retrouvée également in vivo pour une même structure prise à un temps différent, comme entre l’embryon et l’adulte avec une expression cérébrale de la protéine n’atteignant pas un poids moléculaire aussi élevé pour l’adulte que pour l’embryon. Ainsi, il se peut que la maturation de la protéine soit propre à chaque type cellulaire. Nous avons aussi noté que la glycosylation participait à la sécrétion de VSTM2A car la protéine non-glycosylée voit sa sécrétion perturbée. Cette question de la forme fonctionnelle de la protéine active a été soulevée lors de l’étude in vitro de l’impact de cette forme sécrétée, par exemple lors de sa purification. De même, la question du type cellulaire pouvant répondre à la forme sécrétée de VSTM2A était également une interrogation lors de ces expériences. En effet, nous ne connaissions pas le récepteur de VSTM2A (s’il existe), ni même les cellules susceptibles d’être stimulées par ce facteur. Ne pas savoir quel type cellulaire est visé et réagit à la forme sécrétée de VSTM2A
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a définitivement été une grande source de défis qui a retardé notre progression. À ce jour, nous ne savons toujours pas quelle est la cible de cette forme sécrétée.
VSTM2A a la capacité de former des dimères, or cette capacité de la protéine à s’associer en structures quaternaires pourrait participer à l’activité même de la protéine. Par exemple, l’adiponectine peut s’assembler en dimère, trimère, hexamère, dodectamère dont les fonctions biologiques auraient des
conséquences biologiques différentes [809, 810]. Une association de VSTM2A avec d’autres protéines
extracellulaires est également envisageable. Ainsi une immunoprécipitation de la protéine dans le milieu extracellulaire du système dans lequel elle agit pourrait éclairer cette interrogation. Nous pouvons par contre rejeter l’idée de réaliser l’immunoprécipitation de VSTM2A dans un contexte d’engagement adipeux de préadipocytes seuls in vitro car aucun effet de ce côté n’a été démontré pour la forme sécrétée.
De plus, VSTM2A semblerait également avoir plusieurs isoformes d’après les récentes mises à jour des banques de données, cependant leurs rôles indépendants n’ont jamais été explorés. Nous avons fait nos analyses avec un isoforme seulement. Chez la souris nous comptons 2 isoformes avec des tailles différentes. Par rapport à l’isoforme 1 qui compte 252 aa, un épissage alternatif de l’isoforme 2 dans l'exon 3' terminal entraîne un décalage du cadre de lecture et une terminaison N plus courte et distincte donnant 16 aa de moins. Chez l’humain nous comptons 3 isoformes. L’isoforme 1 fait 236 aa. Pour l’isoforme 2 un épissage alternatif dans l'exon 3'-terminal induit une terminaison C plus longue et distincte de l’isoforme 1 de 4 aa supplémentaires. Pour l’isoforme 3, un exon manque et son exon 3'-terminal s'étend au-delà du site d'épissage utilisé dans la variante 1 aboutissant à une terminaison C plus courte et distincte par rapport à l'isoforme 1 mais avec au final 8 aa en plus. À noter que 212 aa sont partagés entre ces 3 isoformes. Ces isoformes peuvent donc participer à rajouter une complexité sur la question de la fonctionnalité de la protéine active.
Un domaine immunoglobuline de type V est présent dans VSTM2A. La fonction de ce domaine n’a pour le moment pas été explorée. Ce domaine est cependant retrouvé dans diverses familles de protéines. Nous le retrouvons par exemple dans les chaines légères et lourdes d’immunoglobulines, dans plusieurs récepteurs de type lymphocyte T, dans des molécules d’adhésion membranaire ou jonctionnelle, dans les récepteurs de protéines tyrosines kinases. Son rôle pour VSTM2A reste encore à élucider.
VSTM2A, une protéine sécrétée mais dans quel but ?
Comme précédemment mentionné, VSTM2A est hautement sécrétée par des cellules à fort potentiel adipogénique, mais cette sécrétion ne contribue pas à l’amplification du potentiel adipogénique des cellules. En effet, aucun résultat convaincant n’est ressorti des nombreuses expériences de culture avec milieu conditionné, d’ajout de protéine purifiée avec des gammes de concentrations et de temps différents, de différenciation de 3T3-L1 en présence d’anticorps contre VSTM2A ou bien d’expériences de co-culture entre
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cellules mésenchymateuses et cellules surexprimants VSTM2A ou son contrôle. Ce résultat nous a laissé perplexe considérant la forte capacité des préadipocytes à sécréter cette protéine. Cependant, après avoir passé plusieurs années à tenter de démontrer l’implication de cette forme extracellulaire dans l’adipogenèse sans résultats suffisamment constants pour supporter cette hypothèse, nous avons dû considérer d’autres
hypothèses. Ainsi, nous avons porté notre intérêt pour un rôle de la forme intracellulaire comme une
surexpression de VSTM2A sans séquence signal peptide, ou non glycosylée (sécrétion entravée) et ces formes sont capables d’induire l’adipogenèse de manière similaire à la forme normale sécrétée. Cela nous amène à la conclusion que seule la forme intracellulaire a un effet sur Pparγ2 et donc le potentiel adipogénique des cellules. Ce résultat peut paraître déroutant mais VSTM2A ne serait pas la seule protéine ayant des rôles différents selon sa localisation intra ou extracellulaire. Nous pouvons citer l’adipokine WISP2 dont il a été rapporté que les formes intracellulaires et extracellulaires ont des rôles différents sur la différenciation adipogénique. En effet, les deux formes impliquent des voies de signalisation diverses : la forme intracellulaire forme un complexe avec ZFP423 empêchant son action sur Pparγ tandis que la forme extracellulaire active la voie WNT canonique inhibant ainsi directement l’activation de Pparγ [615]. Nous pouvons aussi citer PREF1 qui est une protéine transmembranaire et dont seule l’unité clivée à un rôle sur
l’adipogenèse [604, 605].
Le fait que VSTM2A soit hautement sécrétée par les préadipocytes nous pousse à croire que cette forme extracellulaire a un rôle qu’il reste encore à découvrir. Étant donné que le tissu adipeux n’est pas uniquement composé de préadipocytes, il est possible que VSTM2A soit sécrétée par les précurseurs adipeux en développement afin de réguler d’autres processus participant à l’adipogenèse. Il serait intéressant d’explorer un effet sur d’autres types cellulaires et d’autres rôles en lien avec le développement ou l’expansion du tissu adipeux. Cette hypothèse n’a pas pu être testée jusqu’à présent in vitro car seul le modèle de préadipocytes a été soumis à l’action de la protéine.
La première hypothèse qui pourrait être explorée est l’impact de la forme sécrétée sur l’innervation du tissu adipeux. Par la libération de noradrénaline et l’activation du récepteur β, l’innervation sympathique favorise la lipolyse et inhibe la prolifération des précurseurs adipeux. Une action malgré tout dépendante d’un équilibre avec les récepteurs α2-adrénergiques dont l’activation joue le rôle inverse. L’effet de l’innervation sur la prolifération a été démontré chez l’adulte à partir d’expériences de dénervation, mais également chez l’embryon lors de la mise en place du dépôt, puisqu’un statut de sous nutrition chez la mère gestante serait
associé à une altérationsympathique parallèlement à une hyperplasie du dépôt de sa progéniture [811, 812].
Dans ce contexte, nous pouvons spéculer que la sécrétion précoce de VSTM2A lors du développement d’une cellule adipeuse favorise la prolifération des précurseurs adipeux en antagonisant l’action de la noradrénaline, favorisant ainsi l’hyperplasie du tissu. Un mécanisme qui est ensuite limité lors de la phase d’expansion du tissu où l’hypertrophie des cellules ainsi mises en place intervient. Une autre hypothèse est que VSTM2A
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pourrait participer au guidage axonal étant donné que ce processus a également lieu lors de l’expansion du tissu adipeux, là aussi de manière transitoire, le temps que les terminaisons nerveuses se mettent en place aux alentours des nouvelles cellules adipeuses se formant. En effet, certaines banques de données comme
IsoPred - Computational Predictions of Isoform Functions associent VSTM2A à des fonctions de régulation :
d’axonogenèse, de développement de projections neuronales, de morphogenèse cellulaire liée à la différenciation, de transport d’ions transmembranaire (on retrouve aussi la transmission synaptique) [813].
Par ailleurs de nombreuses études soulèvent un lien entre l’activation de PPARγ et la différenciation neuronale ou la polarité axonale [814-817]. D’autre part, la voie des BMP a également été associée à des processus de développement et de différenciation de cellules neuronales [818-821], ainsi que de croissance dendritique, synaptique et axonale [822-825]. Il est alors possible d’envisager que des récepteurs présents sur les cellules nerveuses mais absents des préadipocytes soient sensibles à l’action de VSTM2A et mènent à l’activation de la voie des BMP et/ou de PPARγ dans ces cellules aboutisant à leur développement. Dans le développement cérébral, nous retrouvons aussi l’importance de structures immunoglobulines dans le contrôle de la spécificité synaptique ; or VSTM2A possède une telle structure. Ainsi, si nous nous fions aux données bioinformatiques VSTM2A aurait des structures similaires à des protéines Cell Adhesion Molecules (CADM) dont le rôle est important pour l’organisation des synapses [826, 827]. Ces hypothèses font le lien avec l’expression élevée de VSTM2A dans le cerveau de souris.
Il est aussi possible que la forme sécrétée de VSTM2A puisse moduler le développement du tissu adipeux en affectant l’angiogenèse, ou la migration de cellules immunitaires, deux processus ayant un rôle indispensable dans la mise en place du tissu adipeux [129]. Lors de la formation du tissu adipeux in vivo, l’étroite association des cellules exprimant VSTM2A avec les cellules vasculaires nous incite à explorer l’aspect fonctionnel derrière cette organisation anatomique. De plus, VSTM2A est surexprimé dans de nombreux cancers, une condition favorisant fortement l’angiogenèse. Il est ainsi envisageable que cette corrélation ait une explication biologique [828-832]. Or lors du développement du tissu adipeux, la littérature a clairement décrit que la croissance des vaisseaux sanguins précède la différenciation et la maturation des