Résumé de l’étude 42

Pour savoir si la leptine agit en amont de l’hypothalamus, nous avons passé en revue les différents neurotransmetteurs à la recherche d’un candidat qui puisse réguler à la fois la masse osseuse et l'appétit. Notre intérêt s’est concentré sur la sérotonine. La sérotonine est une indole-amine produite dans les cellules entérochromaffines et dans les neurones sérotoninergiques du tronc cérébral. Elle ne traverse pas la barrière hémato-encéphalique et les deux systèmes –central et périphérique- sont indépendants ⁴³. Chez les invertébrés, la sérotonine stimule fortement l’appétit ⁴⁴. De nombreux autres rôles ont été décrits pour la sérotonine cérébrale mais pour l’instant aucun travail n'a porté sur l’étude de la masse osseuse 45

. En revanche, notre laboratoire a récemment mis en évidence que la sérotonine périphérique régule la formation osseuse ⁴⁶ nous incitant à étudier si la sérotonine cérébrale possède aussi une action osseuse.

1) Effet osseux de la sérotonine cérébrale

La sérotonine est produite à partir du tryptophane par hydroxylation sous l’influence de l’enzyme tryptophane hydroxylase 2 (Tph2) dans le cerveau et Tph1 dans le tube digestif ⁴⁷

L'analyse du phénotype osseux des souris Tph2

. La génération de souris déficientes en Tph2 permet donc d'obtenir un déficit uniquement en sérotonine cérébrale et ces souris ont une sérotonine circulante normale.

-/-

Ce premier résultat montre que la sérotonine cérébrale est un stimulateur important de la masse osseuse. Il indique aussi qu'un neurotransmetteur peut avoir un effet sur la physiologie osseuse.

révèle une masse osseuse basse aussi bien au niveau des os longs qu’au niveau vertébral. Ce phénotype résulte de la combinaison d'une diminution de la formation et d'une augmentation de la résorption osseuse. La minéralisation osseuse chez ces souris est normale.

2) Sérotonine cérébrale et digestive

Les résultats précédents indiquent un rôle opposé sur la masse osseuse entre la sérotonine périphérique d'origine digestive et la sérotonine cérébrale. Pour déterminer quelle sérotonine est prépondérante, nous avons généré des souris doublement déficientes (Tph1^-/-; Tph2^-/-). Elles reproduisent le phénotype de masse osseuse basse des souris Tph2^-/- permettant de conclure que la sérotonine cérébrale est prépondérante.

3) Sérotonine cérébrale et tonus sympathique

Le phénotype osseux des souris Tph2^-/- apparaît en miroir de celui des souris déficientes en récepteur bêta 2 adrénergiques (Adr 4-/-) qui ont un tonus sympathique effondré, suggérant que l’effet osseux de la sérotonine cérébrale passerait par le tonus sympathique. Le dosage de la noradrénaline et l'expression dans la graisse brune de Ucp1 des souris Tph2^-/- sont élevés ce qui signe une augmentation du tonus sympathique et confirme l’aspect en miroir du phénotype. La démonstration génétique a été apportée par les souris (Tph2^-/-; Adr 2^+/-) qui ont un

4) Cartographie neuronale histologique

Deux expériences ont permis la démonstration de la projection axonale des neurones sérotoninergiques sur l'hypothalamus. La première expérience est génétique et utilise le croisement des souris Rosa26-Ecfp avec des souris Sert-Cre. Les souris Rosa-Ecfp expriment après recombinaison l’Ecfp qui est un fluorochrome montrant l’arborisation neuronale. Les souris Sert-Cre expriment la Cre-recombinase dans les noyaux du raphé du tronc cérébral qui contiennent des neurones sérotoninergiques. L’analyse histologique du cerveau des souris (Rosa26-Ecfp ;

Sert-Cre) révèle une fluorescence du noyau arqué et du VMH de l’hypothalamus ce qui

indique que les noyaux du raphé projettent dans le VMH.

La seconde méthode d’analyse des projections axonales repose sur le marquage du noyau du tronc cérébral (raphé) avec du Dextran immédiatement après sacrifice de l’animal. Cette expérience utilise la persistance pendant un court laps de temps, malgré la mort de l’animal, d’un transport axonal antérograde. L’analyse histologique de l’hypothalamus a montré un marquage du VMH et du noyau arqué. L’expérience a été répétée en utilisant le transport axonal rétrograde. Dans cette expérience complémentaire, le marquage de l’hypothalamus a montré un marquage des corps neuronaux dans le raphé.

5) Démonstration génétique de la cartographie neuronale impliquant la

sérotonine

Les deux expériences précédentes signent l’existence de projections axonales à partir des noyaux du raphé dans le tronc cérébral en direction du VMH et du noyau arqué de l’hypothalamus mais n’indiquent pas clairement la nature sérotoninergique de ces neurones qui reste à démontrer.

L’analyse par RT-PCR de l’expression du récepteur de la sérotonine (Htr2c) dans l’hypothalamus montre un niveau d’expression élevé. De plus, par hybridation in situ on observe l’expression de Htr2c dans le VMH et le noyau arqué de l’hypothalamus. Ces résultats ont conduit à la réalisation de souris déficientes en récepteur de la sérotonine (Htr2c^-/-) dont l’analyse du phénotype osseux a montré, une masse osseuse basse liée à une augmentation de la résorption et une diminution de la formation osseuse. Ces souris présentent un tonus sympathique élevé et une hyperphagie. Les souris double hétérozygotes (Tph2^+/-; Htr2c

+/-Enfin, la délétion spécifique des neurones exprimant le récepteur de la sérotonine dans le VMH (LoxTB-Htr2c ; SF1-Cre) est responsable du phénotype de masse osseuse basse.

) reproduisent le phénotype et démontre donc génétiquement que Tph2 et Htr2c sont dans la même cascade pour le contrôle de la masse osseuse.

CONCLUSION INTERMEDIAIRE

La sérotonine cérébrale agit via son récepteur Htr2c sur les neurones présents dans le noyau VMH de l’hypothalamus

6) Connexion leptine et sérotonine cérébrale

Plusieurs expériences ont permis de démontrer que les neurones sérotoninergiques expriment le récepteur de la leptine ObRb. Parmi celles-ci, on retient que l’injection de leptine en intracérébroventriculaire à des souris sauvages, entraine la diminution d’expression de Tph2 dans le raphé et que les souris déficientes en leptine chez qui on délète en plus un allèle de Tph2 (Ob/Ob ; Tph2^+/-) ont une normalisation de leur

sérotonine cérébrale, de leur phénotype osseux et de leur tonus sympathique. L’activité neuronale (potentiel d’action) de ces souris a également été analysée.

CONCLUSION OSSEUSE

La leptine sécrétée par le tissu adipeux inhibe la formation osseuse, via un tonus sympathique élevé, en bloquant l’action positive des neurones sérotoninergiques du

tronc cérébral (raphé) qui projettent leurs axones sur le noyau VMH de l’hypothalamus contrôlant le tonus sympathique.

7) Régulation de l’appétit et du métabolisme énergétique

Comme la démonstration précédente a permis d’établir le lien osseux entre la leptine et la sérotonine, la deuxième question posée par l’article est de savoir si la régulation de l’appétit par la leptine se fait par l’intermédiaire de la sérotonine puisque nous avons vu en préambule que, comme pour l’os, la régulation de l’appétit était altérée en cas de destruction chimique du noyau arqué de l’hypothalamus mais pas lorsque le récepteur de la leptine était spécifiquement délété dans le noyau arqué.

La sérotonine était là encore un bon candidat puisque les souris Tph2^-/- ont outre leur phénotype osseux une diminution de l’appétit, une faible graisse viscérale et une dépense énergétique élevée. Un des éléments de la démonstration est l’obtention de souris déficientes en récepteur de la leptine spécifiquement dans le tronc cérébral (ObRb^fl/fl; Sert-Cre) qui récapitule le phénotype des souris ob/ob dont

le phénotype est non seulement marqué par une masse osseuse élevée et un tonus sympathique bas mais aussi par une hyperphagie, une obésité et une faible dépense énergétique. Ces souris ont une sérotonine cérébrale élevée.

CONCLUSIONS

1) La leptine agit dans le tronc cérébral en freinant les neurones sérotoninergiques qui projettent sur l’hypothalamus pour controler la masse osseuse (noyau VMH) et l’appétit (noyau arqué).

2) La sérotonine cérébrale

‚ abaisse le tonus sympathique et donc stimule la masse osseuse ; ‚ stimule l’appétit (orexigénique) et diminue la dépense énergétique. 3) La leptine :

‚ augmente le tonus sympathique et donc freine la masse osseuse ; ‚ freine l’appétit (anorexigénique) et stimule la dépense énergétique.