Introduction et hypothèse de travail

La compréhension des interactions entre l'os et le métabolisme énergétique constitue un paradigme de la physiologie intégrative. Le déchiffrage de ces relations a été permis par les progrès récents de la génétique et des techniques de souris transgéniques. L'obtention de souris dites knock-out, c'est-à-dire globalement déficientes pour un gène, par Mario Capecchi et Oliver Smithies fut déjà une étape historique récompensée en 2007 par le Prix Nobel de Physiologie et de Médecine. Par la suite, l'arrivée des systèmes Cre/lox a permis de réaliser des délétions géniques conditionnelles spécifiquement dans un tissu donné, là où est exprimée la

Cre recombinase. Cette méthode permet d'observer les modifications induites à

distance dans les autres tissus. Ceci implique une bonne caractérisation du profil d'expression de la Cre recombinase au préalable. Le profil d’expression dépendra du promoteur utilisé et variera non seulement dans les différents tissus, les étapes de différenciation cellulaire mais également en fonction des stades de développement de l'organisme (stades embryonnaires, adulte etc…). Le choix du modèle Cre

recombinase utilisé est donc essentiel. La tendance actuelle pousserait à utiliser

différentes Cre recombinase pour confirmer l’effet observé. Cependant ceci se heurte à des problématiques financières et techniques car les modèles Cre/lox demandent la réalisation de nombreux croisements et la génération d'un très grand nombre de souris ².

Le modèle d'interactions entre l'os et le métabolisme énergétique présenté ici a été établi de façon formelle par les expériences in vivo utilisant de nombreux modèles de souris transgéniques. Figure 10. La force de ces expériences est de pouvoir isoler l'action d'un gène et de l'étudier dans l'ensemble de l'organisme vivant au sein de l’environnement contrôlé de l'animalerie. Une fois le modèle établi, deux questions se posent. Le système identifié est-il fonctionnel chez l'homme étant donné le changement d'espèce ? Quelle est la pertinence du système identifié pour la pathologie humaine dans le contexte de redondance des mécanismes de l'organisme et des multiples facteurs environnementaux auxquels est soumis l’individu sachant qu’un modèle KO a généralement un effet « loupe » pour l’étude de la fonction du gène.

Jusqu’alors, aucune preuve de l'action directe de l'ostéocalcine chez l'homme n’était disponible. L’observation de taux sériques d’ostéocalcine bas chez les diabétiques de type II s’améliorant avec le contrôle de la glycémie semblait confirmer les observations chez l’animal ¹⁰⁵. Il est donc apparu nécessaire d'apporter des preuves de concept du rôle de l'ostéocalcine sur la régulation du glucose chez l'homme.

l’intermédiaire d’un contrôle central de la masse osseuse.

L’os régule le métabolisme énergétique en sécrétant une hormone : l’ostéocalcine active sur le pancréas (stimulation de la sécrétion d’insuline, de la prolifération des cellules et le tissu adipeux (augmente l’insulinosensibilité périphérique via la production d’adiponectine par les adipocytes) ¹⁰⁶.

En pathologie humaine, pour toute hormone, il existe une tumeur bénigne sécrétante. Nous avons donc émis l'hypothèse qu’il devait exister des tumeurs bénignes ostéoblastiques de l'adulte jeune qui pourraient sécréter de l'ostéocalcine. La tumeur ostéoblastique bénigne la plus fréquente est l'ostéome ostéoïde qui survient le plus souvent chez l'adulte jeune. Son équivalent chez l'enfant est l'ostéoblastome.

Nous avons donc mis en place un partenariat entre les services d'orthopédie du New York Presbyterian Hospital, New York - NY, USA (Dr Francis Lee) et des Hospices Civils de Lyon, Lyon - France (Pr Jacques Béjui-Hugues, Pr Jean-Paul Carret, Pr Guillaume Herzberg, Pr Rémi Kohler) pour évaluer l'effet de la résection chirurgicale des ostéomes ostéoïdes sur les taux sériques d'ostéocalcine et de la glycémie. Nous avons pris comme témoins des patients jeunes sans antécédent subissant une intervention bénigne du genou et des volontaires sains non opérés. La justification des contrôles était d’éliminer un effet lié à la procédure chirurgicale et à l’anesthésie elle-même.

Nous avons obtenu auprès des comités d'éthique de chaque hôpital les autorisations nécessaires pour réaliser cette étude non interventionnelle. Les prises de sang ont été réalisées le jour et le lendemain de l’intervention dans les mêmes conditions à savoir une prise de sang le matin avant 8 heures chez un patient à jeun depuis minuit. Durant toute l'hospitalisation, les patients ne devaient pas recevoir de perfusion contenant du glucose. L'évaluation portait sur les éléments suivants : dosage des marqueurs sériques osseux, (CTX, PAL osseuses), de la glycémie, de l'insuline, de l'ostéocalcine à T0 et T1. Les techniques de radiologie interventionnelle et de forage biopsique sous scanner (FROP) n'ont pas été retenues compte tenu de l'impossibilité de réaliser un contrôle histologique ¹⁰⁸.

Sept jeunes hommes âgés entre 22 et 38 ans ont pu être inclus dans l'étude. Leur index de masse corporelle moyen était de 23 et tous avaient une hémoglobine glycosylée normale. Parmi ces patients, deux avaient un ostéome ostéoïde, deux une chirurgie du genou bénigne et trois étaient des volontaires sains. À l'issue de la chirurgie, les ostéomes ostéoïdes avaient une disparition complète de leur douleur comme attendu. La résection chirurgicale de la tumeur s'est accompagnée d'une chute brutale du taux sérique d'ostéocalcine de 62 % et 30 % par rapport au taux initial. Dans le même temps ces patients connaissaient une hausse de leur glycémie de respectivement 32 % et 15 %. En comparaison les témoins sains et les patients contrôles présentaient un taux sérique d'ostéocalcine stable. Le dosage de l'ostéocalcine non carboxylée chez ces deux patients a montré également une baisse après l'intervention. Les variations de l'ostéocalcine sont spécifiques par rapport aux autres marqueurs osseux puisque chez tous les patients les phosphatases alcalines osseuses et les CTX étaient stables. On observait également, en réponse à cette chute d'ostéocalcine, une diminution à 24h de l'activité des cellules

la mesure du HOMA- (HOmeostatic Model Assessment) et une augmentation de l'insulinorésistance mesurée par HOMA-R.

résultats observés chez l'animal et peut être considérée comme une preuve de concept. Elle suggère que l'ostéome ostéoïde serait une tumeur bénigne sécrétante de l'ostéocalcine, une sorte d’ « ostéocalcinome ». Cette étude constitue la première démonstration de l'action directe de l'ostéocalcine sur le métabolisme glucidique chez l'homme.

III- Focus sur l’ostéocalcine humaine et son dosage

L'ostéocalcine est une petite hormone protéique de 49 acides aminés et 110 kDa synthétisée par les ostéoblastes matures, l’odontoblaste et les chondrocytes hypertrophiques. Elle fait partie du groupe des protéines non collagéniques de la matrice osseuse.

Le gène de l'ostéocalcine humaine (BGLAP-001) est situé sur le chromosome 1q25-q31 mesure 732 pb et comprend 4 exons. Un deuxième gène adjacent

BGLAP-002 est un pseudo gène non codant. Le gène de l'ostéocalcine n'est pas exprimé par

les cellules non osseuses. Il n'est pas non plus exprimé dans les stades précoces prolifèratifs de l'ostéoblaste. L'ostéocalcine constitue donc un marqueur de différentiation des ostéoblastes matures.

La transcription du gène de l'ostéocalcine est sous la dépendance du facteur de transcription Runx2/Cbfa1 ^{97, 110-114}. Le promoteur du gêne de l'ostéocalcine comprend dans l’ordre du plus loin au plus près de la TATA box : 1 site Runx2 (-600pb), 1 site de réponse à la vitamine D (VDRE – Vitamin D Response Element), 1 site Runx2 et un 1 site C/EBP (-70 pb). Il existe également des sites AP-1. Le site VDRE fonctionne comme un potentialisateur de l’expression de l’ostéocalcine ^{115 , 116}.

L'ostéocalcine est produite sous forme de pro-peptide de 100 acides aminés qui est clivé durant la maturation dans le reticulum endoplasmique. Elle comprend un pont disulfure entre C23 et C29 et trois résidus acid -carboxyglutamique (Gla)

(E17, E21 et E24) -carboxylation est une

modification post-traductionnelle vitamine K dépendante réalisée par l’enzyme VKORC dans le réticulum endoplasmique. Plus de 95% de l'ostéocalcine produite par l'ostéoblaste dans les conditions normales est carboxylée. La forme carboxylée a une forte affinité pour l’hydroxyapatite et reste donc dans la matrice osseuse. Seule une faible quantité passe dans le sang rejoignant la forme non carboxylée directement sécrétée par les ostéoblastes ^{117, 118}. Le pool sanguin comprend également de l'ostéocalcine issue de la résorption par les ostéoclastes et relarguée dans la circulation. L'ostéocalcine circulante est filtrée par le glomérulre rénal et éliminée. La demi-vie plasmatique de l'ostéocalcine chez l'homme est estimée à 20 minutes. Les concentrations sériques d'ostéocalcine sont inversement corrélées avec la clairance de la créatinine ¹¹⁹.

L’ostéocalcine sérique suit un rythme circadien caractérisé par une diminution progressive au cours de la matinée pour atteindre un minimum à midi. Ensuite, on note une augmentation progressive jusqu'à atteindre un pic après minuit. La différence entre le pic et le nadir sur une durée de 24 heures peut aller de 10 à 20 %

également noté une augmentation significative de l’ostéocalcine durant la phase lutéale du cycle menstruel ¹²⁴.

Les taux sériques sont plus élevés chez l'enfant que chez l'adulte et sont bien corrélés avec la vitesse de croissance. Le taux maximal d'ostéocalcine sérique est atteint à la puberté. Chez l'adulte, les taux circulants d'ostéocalcine sont plus élevés chez l'homme que chez la femme. Par la suite, il existe une diminution progressive des taux d'ostéocalcine avec l'âge en dehors d'une ascension transitoire après la ménopause chez la femme ¹²⁵. Bien que la formation osseuse soit normalement augmentée au troisième trimestre de la grossesse, les taux d'ostéocalcine n'augmentent pas ¹²⁶. En cas de fracture, l'ostéocalcine est augmentée et persiste élevée pendant au moins trois mois ¹²⁷. Certaines situations cliniques comme l'hyperthyroïdie s'accompagnent d'une augmentation de l'ostéocalcine. La démonstration de l'action de la T3 a été apportée in vitro avec des cellules ROS17/2.8 ^128-131.

Dans notre étude, le dosage de l'ostéocalcine non carboxylée est réalisé de la façon suivante selon la méthode d'hydroxy-apatite (HAP). Dans nos mains, le kit Takara® donne des résultats médiocres avec beaucoup de variations.

1. Peser 7.5 mg d’HAP sur une balance de haute précision dans un tube Eppendorf

2. Ajouter 250 μl de serum à doser. 3. Agiter les échantillons (Vortex).

4. Incuber pendant 1 heure à température ambiante sur un agitateur lent (end over end).

5. Centrifuger les échantillons à 2500 rpm pendant 15 min.

6. Puis doser simultanément sur l’automate Elecsys® 2010 (Roche Diagnostics, Mannheim, Allemagne) l’ostéocalcine dans le sérum natif et après passage sur la colonne d’HAP. On obtient une valeur d’ostéocalcine totale et une valeur d’ostéocalcine non carboxylée que l’on peut exprimer soit en valeur brute (ng/mL) soit en en pourcentage du total.

NB : Le pourcentage d'ostéocalcine carboxylée est obtenu par soustraction de la valeur non carboxylée à celle du dosage d'ostéocalcine totale divisé par la totale.

NB2 : Ce dosage ne permet pas de différencier les formes partiellement carboxylées.

Référence HAP : poudre de calcium phosphate tribasique C5262 Sigma-Aldrich St Louis, Missouri USA.

IV- Article

Osteoid osteoma is an osteocalcinoma