Résultats

Les protéines PH-20 et SPAM1 partagent plusieurs caractéristiques

D’abord, PH-20 est une protéine prédite ayant 550 acides aminés et un poids moléculaire (PM) théorique de ~60,5 kDa tandis que SPAM1 est une protéine de 553 acides aminés ayant un PM théorique de 60,8 kDa. Cependant, comme SPAM1 est une protéine fortement N- et O-glycosylée (Chapitre 2, Morin et al., 2005; Morin et al., 2010), elle migre selon un PM de 70 et 80 kDa lors de SDS-PAGE, selon les isoformes potentielles. Il y a 81,3% d’identité et 88,7% de similarité entre les séquences nucléotidiques codantes de Ph-20 et Spam1. De plus, il y a 69,4% d’identité et 87,5% de similarité entre les séquences protéiques complètes de PH-20 et SPAM1 (Figure 3-4). Plus particulièrement, les domaines N-terminaux hyaluronidases (acides aminés 42 à 371 pour SPAM1 et 40 à 368 pour PH-20) ont 72,1% d’identité et 90,3% de similarité. Les domaines C-terminaux (acides aminés 372 à 553 pour SPAM1 et 369 à 550 pour PH-20) ont 62,5% d’identité et 80,4% de similarité. On y retrouve aussi chez PH-20 une suite de quatre acides aminés, KPKD, constituant le motif probablement reconnu par l’anticorps N-terminal. La région soulignée à la Figure 3-4 démontre le peptide reconnu par l’anticorps polyclonal C- terminal.

Tel que mentionné, PH-20 est composé de 550 acides aminés et le PM moléculaire théorique est d’environ 60 kDa. Dans l’évènement où PH-20 est réellement la « deuxième isoforme » de SPAM1 (environ 70 kDa), il doit y avoir des modifications quelconques (post-traductionnelles) afin d’expliquer le poids moléculaire plus lourd. Puisque SPAM1 est hautement glycosylé (Chapitre 2; Morin et al., 2005; Morin et al., 2010), et que les séquences protéiques sont très semblables, il est probable que ces deux protéines partagent des sites de glycosylation. Des analyses in silico pour des sites de N- et d’O-glycosylation ont été faites ainsi que pour la détection d’un peptide signal et d’un domaine transmembranaire. De nombreux sites de glycosylation ont été trouvés. En fait, il existe 7 sites potentiels de N-glycosylation et 15 sites potentiels d’O-glycosylation (Figure 3-5). De façon intéressante, le nombre de sites total de glycosylation ainsi que le regroupement en C-terminal de l’O-glycosylation ressemblent beaucoup à ce qu’on retrouve chez la protéine

SPAM1. La glycosylation de PH-20 pourrait donc expliquer le poids moléculaire réel plus élevé que celui qui est théorique, estimé à partir de la composition en acides aminés.

Figure 3-4 Comparaison des séquences protéiques de SPAM1 et PH-20. Les acides aminés en communs sont en rouge, la région potentiellement reconnue par l’anticorps N-terminal est encadrée et la région reconnue par l’anticorps C-terminal est soulignée. Numéros d’accès : XP_002686960 (PH-20) et AAI10184 (SPAM1).

Figure 3-5 Schématisation des caractéristiques potentielles de la protéine prédite PH-20. Aucun peptide signal n’a été détecté, mais deux domaines transmembranaires ont été trouvés. Il existe 7 et 15 sites potentiels de N- et d’O-glycosylation, respectivement. Figure créée utilisant le programme IBS (http://ibs.biocuckoo.org/) (Liu et al., 2015).

Le transcrit Ph-20 est présent dans les tissus testiculaires et épididymaires

bovins

Des amplifications ont été effectuées utilisant l’ARN des tissus testiculaires et épididymaires afin de vérifier l’expression de Ph-20. Deux amplifications successives ont été effectuées afin d’augmenter le potentiel de détection du transcrit dans les tissus. Après une série d’amplification, une bande de 1494 pb a été détectée uniquement dans le testicule (Figure 3-6). Par la suite, la deuxième série d’amplifications a révélé la présence d’une bande de 1035 pb du transcrit Ph-20 dans le testicule et dans la tête de l’épididyme. Aucun signal n’a été détecté dans la queue de l’épididyme, et ce, même après deux séries d’amplifications. Ces résultats suggèrent néanmoins une plus forte expression dans le testicule comparativement à l’épididyme (tête).

Figure 3-6 Amplification du transcrit Ph-20 dans les tissus testiculaires et épididymaires bovins. Après la première série d’amplification, une bande faible de 1494 pb est détectable seulement dans le testicule (image du haut). Après la deuxième série d’amplification, deux bandes fortes de 1035 pb dans le testicule et dans la tête de l’épididyme (image du bas)

Production de la protéine recombinante PH-20

Le transcrit Ph-20 a d’abord été amplifié utilisant des amorces ayant des sites de restrictions. Ces sites de restrictions ont permis l’insertion unidirectionnelle de l’amplicon Ph-20 dans le vecteur d’expression. Ce vecteur contenant Ph-20 a ensuite été cloné utilisant des cellules qui peuvent exprimer la protéine recombinante, qui peut, elle, être purifiée et identifiée par immunobuvardage.

La coloration à l’argent des différentes fractions révèle une très faible bande dans la fraction éluée à un poids moléculaire autour de celui attendu pour PH-20 (Figure 3-7). Cependant, l’immunobuvardage pour la détection de PH-20rec a révélé que cette protéine n’a pas été produite, car il n’y avait aucun signal (par les 3 anticorps utilisés) dans les fractions testées : cellules totales, soluble, insoluble et éluée (Figure 3-8). Donc, comme l’anticorps dirigé contre l’étiquette poly-histidine n’a reconnu aucune protéine dans la fraction éluée, nous pouvions conclure que notre tentative de production de PH-20rec avait échoué. L’identité de la protéine éluée demeure inconnue.

Figure 3-7 Coloration à l’argent des protéines des fractions des étapes d’expression et de purification de PH-20rec. Puits : fractions totale (Tot), soluble (Sol), insoluble (Ins) et l’élution (Él). SPAM1 des spermatozoïdes totaux (0,5 x 106

spermatozoïdes) sert de contrôle positif pour en immunobuvardage (Spz tot). La faible bande dans l’élution est indiquée par la flèche rouge.

Figure 3-8 Immunobuvardage des fractions de l’expression et de la purification de la protéine recombinante PH-20rec. Puits: fraction totale (Tot), soluble (Sol) et insoluble (Ins) des bactéries, et l’élution (Él). SPAM1 des spermatozoïdes totaux (0.5 x 106 spermatozoïdes) sert de contrôle positif pour les anticorps N- et C-terminaux. Aucune bande n’est détectée dans la fraction éluée alors que plusieurs bandes non spécifiques sont détectées dans les fractions totales, solubles et insolubles.

3.4 Discussion

Chez plusieurs espèces, il y a de nombreux gènes qui encodent des hyaluronidases. Par contre, de ces hyaluronidases, seule SPAM1 (ou anciennement PH-20) possède deux fonctions : activité hyaluronidase et liaison à la zone pellucide (Hunnicutt et al., 1996; Lalancette et al., 2001; Morin et al., 2010). Cependant, chez l’espèce bovine, en plus des gènes du type « Hyal » (Hyal1, Hyal2, Hyal3, Hyal4; NCBI), il y a à la fois présence du gène Spam1 et Ph-20. Le gène Ph-20 (LOC509761) est situé sur le chromosome 4, en aval du gène Spam1. À la quête d’identifier les différences entre les isoformes potentielles de SPAM1 (Chapitre 2), une possibilité d’« erreur d’identité » pourrait être survenue pour la deuxième isoforme (de 70 kDa). C’est-à-dire, notre anticorps N-terminal reconnaîtrait possiblement à la fois le domaine N-terminal de SPAM1 et de PH-20. En comparant les séquences protéiques de SPAM1 et PH-20, il est évident qu’elles sont très similaires (Figure 3-4). En fait, il y a 69,4% d’identité et 87,5% de similarité entre les acides aminés des deux protéines. Notre anticorps N-terminal reconnaît très probablement la suite d’acides aminés KPKD dans la région N-terminal de SPAM1, et ces acides aminés sont aussi retrouvés chez PH-20 (Figure 3-1). Compte tenu de ceci, on a voulu déterminer si la protéine PH-20 était aussi présente dans les spermatozoïdes et si notre anticorps N-terminal reconnaissait PH-20. Pour ce dernier aspect, nous voulions produire une protéine recombinante PH-20 pour déterminer si elle est reconnue par immunobuvardage.

En premier lieu, on a voulu vérifier si le transcrit Ph-20 était présent dans les tissus bovins. Des expériences de PCR ont révélé que le transcrit Ph-20 était bel et bien présent dans le tissu testiculaire ainsi que dans la tête de l’épididyme. Aucun transcrit n’a été trouvé dans la queue de l’épididyme, même après deux séries successives d’amplification (Figure 3-6). L’absence du signal dans la queue de l’épididyme n’était pas due à une dégradation de l’ARN, car la vérification sur gel d’agarose montrait qu’il était d’une bonne qualité. De plus, des amplifications effectuées utilisant l’ADNc issu de cet ARN de la queue avec des amorces spécifiques à Spam1 et à la β-actine bovine ont donné des signaux positifs.

La présence du transcrit Ph-20 étant confirmée, nous avons entrepris la production de la protéine recombinante PH-20. Le vecteur pET-16b a été choisi, car il contient une séquence encodant une étiquette poly-histidine permettant une purification efficace de la protéine recombinante par colonne Ni2+-sépharose. Chaque étape du processus d’expression et de purification a été vérifiée par SDS-PAGE et immunobuvardage à l’aide d’anticorps dirigés contre l’étiquette poly-histidine et contre les portions N- et C-terminale de SPAM1. La présence de la protéine recombinante a d’abord été vérifiée par la coloration à l’argent du gel polyacrylamide après SDS-PAGE. Une bande très faible était détectable dans la fraction éluée et correspondait à environ le poids moléculaire attendu pour PH-20 (Figure 3-7). Par immunobuvardage, aucun signal n’a été détecté avec l’anticorps anti-His-tag, ce qui indique que la protéine recombinante n’a pas été produite (Figure 3-8). De plus, aucun signal indiquant la présence de PH-20rec n’a été détecté dans les fractions totales, solubles, insolubles et dans l’élution avec nos autres anticorps (N- et C-terminaux).

Malgré les vérifications réalisées à chaque étape, nous avons conclu qu’il y avait un problème à l’étape de la ligature de l’amplicon Ph-20r dans le vecteur pET-16b. Nous avons tiré cette conclusion, car le rendement des colonies après la transformation était toujours très faible, alors que la transformation avec le vecteur pET-16b intact était adéquate. D’innombrables essais et changements au protocole ont été effectués pour remédier à ce problème. Voici certaines des modifications : changement de méthode production des vecteurs pET-16b (MiniPrep à MidiPrep), enzymes neuves pour la digestion du vecteur pET-16b, changement des paramètres de digestion (p. ex. durée, digestion simultanée ou successive avec les deux enzymes, ordre des digestions, quantité d’enzyme), nouveau protocole pour l’obtention et la digestion de l’insert Ph-20r (production utilisant pGEM-T Easy, voir section Matériels & Méthodes), différente température pour la ligature de Ph-20r dans le vecteur (4°C et 16°C) et différentes bactéries pour la transformation (cellules BL21 ou ABLE C). Malgré ces efforts, le rendement de la transformation était toujours décevant. Compte tenu du fait que le plasmide final (insert de ~1700 pb et pET- 16b de 5700 pb) est gros, il se peut que l’entrée du plasmide se trouve à être trop difficile pour des cellules compétentes « régulières ». D’ici, quelques modifications sont planifiées telles que l’utilisation des cellules ultra-compétentes, afin d’amplifier la production du

vecteur pET-16b contenant notre insert encodant PH-20rec pour finalement transformer plus efficacement les cellules BL21 et enfin produire la protéine recombinante PH-20.

Récemment, une expérience qui avait pour but d’identifier les partenaires potentiels de SPAM1 (voir Chapitre 4), des échantillons protéiques (provenant de spermatozoïdes totaux) ont été envoyés pour une analyse par spectrométrie de masse LC-MS/MS. La digestion avec la trypsine suivie par l’analyse des peptides a révélé le peptide MCSQVLCHEEGVCTR qui est unique à PH-20 de Bos taurus. De plus, quelques peptides qui sont communs à PH-20 et SPAM1 sont souvent identifiés : AVIDWENWRPTW,

SFMQETLKLGK, VRNRVQEAIRL, IINVTLAAKMCSQVL et LHLNPMNF.

L’identification du peptide unique représente la première évidence que la protéine PH-20 existe dans les spermatozoïdes bovins. De ce fait, il est donc autant plus important de déterminer si notre anticorps N-terminal peut reconnaître PH-20 par la production de PH-20 recombinant. Ce serait très intéressant de pouvoir déterminer si PH-20, comme SPAM1, a une activité hyaluronidase (et à quel pH cette activité est optimale) et possède une capacité à se lier à la ZP.

Concernant les étapes de la fécondation, le concept courant est qu’il y a plusieurs protéines qui ont des fonctions redondantes. Étant donné que la fécondation est un processus très important, il ne serait pas étonnant que PH-20 joue un rôle d’appoint pour SPAM1, d’où l’intérêt de caractériser PH-20. Puisque nous n’avons pas pu produire la protéine PH-10 recombinante, nous n’avons pas pu déterminer si notre anticorps N-terminal peut détecter la protéine PH-20 et, par le fait même, nous n’avons pu confirmer si PH-20 est réellement ce que nous considérons comme la deuxième isoforme de SPAM1 détectée par l’anticorps N-terminal dans les spermatozoïdes bovins.