Les partenaires d’interactions de SPAM1
4.1 Introduction
Il est bien connu que les processus impliqués dans la fécondation sont très complexes. Une panoplie de protéines sont impliquées dans les voies de signalisation pendant la capacitation et la réaction de l’acrosome, dans le passage des spermatozoïdes au travers du cumulus oophorus et la liaison et la pénétration de la zone pellucide par les spermatozoïdes. Une de ces protéines est SPAM1, présente dans les spermatozoïdes chez de nombreuses espèces telles que les souris, les rats, les humains, les bovins (Lathrop et al., 1990; Thaler et Cardullo, 1995; Hou et al., 1996; Sabeur et al., 1997; Lalancette et al., 2001). Elle possède à la fois une activité hyaluronidase (domaine N-terminal) et une capacité de liaison à la zone pellucide de l’ovocyte (domaine C-terminal) (Hunnicutt et al., 1996). Ces fonctions ont été confirmées chez plusieurs espèces, dont l’espèce bovine (Lalancette et al., 2001; Morin et al., 2005; Morin et al., 2010).
Puisqu’il n’y a pas de transcription active dans les spermatozoïdes, ces derniers se fient aux modifications post-traductionnelles de ces nombreuses protéines, comme la phosphorylation et la glycosylation, afin de féconder l’ovocyte. La phosphorylation sur le résidu tyrosine est intimement liée à la capacitation et à la réaction de l’acrosome (revues : Urner et al., 2001; Urner et Sakkas, 2003; Breitbart, 2003). Cependant, Urner et al. (2001) ont indiqué qu’il avait un manque d’information au sujet de la phosphorylation et les interactions entre les gamètes. En étudiant la phosphorylation sur tyrosine, Asquith et al. (2004) ont trouvé que certaines protéines chaperonnes étaient phosphorylées pendant la capacitation, activant ainsi la formation d’un complexe multiprotéique capable d’interagir avec la zone pellucide de l’ovocyte. Des études subséquentes ont révélé la présence de plusieurs complexes associés aux chaperonnes tels que : (1) la chaperonne CCT/TRiC et la protéine de liaison à la zone pellucide 2 (ZPBP2) chez la souris (Dun et al., 2011), (2)
l’enzyme de conversion de l’angiotensine (ACE), la protéine isomérase disulfide A6 (PDIA6) et la chaperonne Heat Shock Protein A2 (HSPA2) chez l’humain (Bromfield et al., 2016) et (3) l’arylsulfatase A (ARSA), SPAM1 et HSPA2 chez l’humain (Redgrove et al., 2013). En ce qui concerne ce dernier complexe, il a été proposé qu’avant la capacitation, SPAM1 serait orienté vers le milieu extracellulaire, permettant l’interaction avec les cellules du cumulus, potentiellement pour la digestion de l’acide hyaluronique. Après la capacitation, le complexe HSPA2-SPAM1-ARSA se réorienterait de façon à ce que l’ARSA soit vers l’extérieur afin d’interagir avec la zone pellucide (Bromfield et al., 2016).
Étant donné que SPAM1 fait partie d’un complexe impliqué dans les interactions spermatozoïdes-ovocyte chez l’humain, nous avions comme but de déterminer si un processus similaire existe aussi chez l’espèce bovine. Afin de pouvoir étudier ces complexes multiprotéiques et identifier ses composantes, ces complexes doivent être maintenus ensembles. Ceci peut être fait soit en solubilisant les complexes en conditions natives ou en fixant les protéines pour ensuite les solubiliser. La première méthode, l’électrophorèse par gel de polyacrylamide en conditions natives avec du bleu de Coomassie (Blue native polyacrylamide gel electrophoresis; BN-PAGE), a originalement été développée afin d’isoler les complexes de la chaîne respiratoire des mitochondries (Schägger et von Jagow, 1991). D’abord, les protéines sont solubilisées dans des conditions natives (les protéines retiennent leur conformation et leurs activités originales). Ces complexes sont ensuite séparés selon leur poids moléculaire (toujours sous conditions natives). Finalement, les protéines des complexes sont elles séparées par SDS-PAGE selon leur poids moléculaire sous des conditions dénaturantes et réductrices (Reisinger et Eichacker, 2006). Les protéines peuvent ensuite être identifiées par spectrométrie de masse ou par immunobuvardage. Cette procédure requiert beaucoup de temps et ne garantit pas de garder les complexes transitoires intacts, d’où l’utilité de la deuxième méthode : la fixation utilisant le formaldéhyde. Le formaldéhyde est utilisé depuis très longtemps pour la fixation des protéines et des tissus. Cette petite molécule peut facilement traverser les membranes cellulaires et agit rapidement, ce qui permet de fixer les liens protéines-protéines (et protéines-ADN) (Sutherland et al., 2008). L’aspect de la rapidité de la formation des liens
covalents entre les protéines (réticulation) est particulièrement intéressant pour la caractérisation des complexes transitoires. Le formaldéhyde forme des liens avec les groupements amines en N-terminal et des chaînes latérales des acides aminés arginine, cystéine, histidine et lysine (Metz et al., 2003). Cependant, un désavantage est l’identification des faux positifs. Bien que la distance requise pour la réticulation soit entre 2,3 à 2,7 Å, certaines protéines peuvent être rapprochées sans nécessairement être en complexe (Sutherland et al., 2008). C’est pour cette raison que plusieurs contrôles ainsi qu’une analyse critique des résultats sont essentiels.
Des expériences de fixation des complexes au formaldéhyde et d’identification des protéines des complexes par spectrométrie de masse ont été réalisées. Nous avons trouvé que SPAM1 chez l’espèce bovine interagit potentiellement avec des protéines de la gaine fibreuse de la pièce principale du flagelle, les A-kinase anchoring proteins (AKAPs), ou aussi avec ACRBP (Acrosin binding protein) et la GSTM3 (Glutathion s-transferase mu 3). Les AKAPs sont des protéines d’échafaudage qui rassemblent des protéines (par leur domaine de liaison aux AKAPs) impliquées dans les voies de signalisation, facilitant la transduction du signal. Des expériences supplémentaires sont nécessaires afin de confirmer ce partenariat entre SPAM1 et les AKAPs, l’ACRBP et la GSTM3. Les implications potentielles de ces interactions non attendue par SPAM1 seront toutefois discutées.
4.2 Matériels et méthodes
Anticorps
Nous avons deux anticorps qui reconnaissent SPAM1. Le premier est un anticorps monoclonal qui a été produit à partir d’une culture d’hybridomes (American Type Culture Collection, Manassa, VA). Cet anticorps reconnaît la région N-terminale de la protéine SPAM1 dans les spermatozoïdes bovins (Lalancette et al., 2001; Morin et al., 2005; Morin et al., 2010), donc sera nommé l’« anticorps N-terminal ». Le deuxième est un anticorps polyclonal qui a été développé contre un peptide de la région C-terminale de SPAM1 bovin (acides aminés 535 à 550). Puisqu’il reconnaît la région C-terminale, il sera nommé l’« anticorps C-terminal ». Les anticorps anti-AKAP3 (Proteintech, Rosemont, IL) et anti- AKAP4 (GeneTex, Irvine, CA) sont des anticorps polyclonaux.
Préparation des spermatozoïdes
La semence bovine fraîchement éjaculée a été fournie par l’Alliance Semex Inc. (St- Hyacinthe, QC). La semence a été transportée à 18°C et a été traitée dans les 2,5 h suivant la collecte. Les spermatozoïdes ont été lavés à trois reprises avec du D-PBS (0,5 mM MgCl2, 2,7 mM KCl, 137 mM NaCl, 0,9 mM CaCl2, 1,5 mM KH2PO4 et 8,1 mM Na2HPO4) par centrifugation à 500 x g, 10 min, température ambiante. La concentration des spermatozoïdes a ensuite été évaluée avec un hémacytomètre.
Fixation des protéines des spermatozoïdes
Les étapes de fixation sont basées sur le protocole de Klockenbusch et Kast (2010). Les spermatozoïdes ont été incubés dans du PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4 et 8,1 mM Na2HPO4, pH 7,4) en présence ou non de formaldéhyde (1% v/v final) à une concentration de 25 x 106 spermatozoïdes/mL. Les spermatozoïdes ont été fixés pendant 7 min avec rotation et récupérés par centrifugation à 1000 x g pendant 3 min à la température ambiante, pour une exposition totale au formaldéhyde de 10 min. Afin de terminer la réaction de réticulation, les spermatozoïdes (fixés et contrôles) ont été lavés à deux reprises par centrifugation (1000 x g, 8 min, température ambiante) avec une solution
de glycine (1,25 M) dans du PBS (4°C). Les protéines des spermatozoïdes ont ensuite été solubilisées avec du tampon d’échantillon (62,5 mM Tris HCl pH 6,8, 10% glycérol, 50 mM DTT, 2% SDS, 0,05% bleu de bromophénol) à 37°C pendant 30 min et centrifugés à 18000 x g pendant 5 min à la température ambiante afin de récupérer la fraction soluble. La solubilisation à 37°C, selon l’article, était la température à privilégier afin de préserver les complexes.
Immunodétection des complexes protéiques potentiels
Les protéines extraites des spermatozoïdes après fixation au formaldéhyde ont été séparées par SDS-PAGE sur un gel à gradient 5 à 10% de polyacrylamide. Les protéines ont été transférées sur une membrane polyfluorure de vinylidène (PVDF) avec le système Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad, Mississauga, ON, Canada). Les sites non- spécifiques de la membrane PDVF ont été bloqués avec du lait écrémé 5% (p/v) dans une solution saline tamponnée avec du Tris et contenant du Tween (TBST; 150 mM NaCl, 20 mM Tris HCl pH 7,4 et 0,1% (v/v) Tween 20) pendant 2 h à température ambiante. Ensuite, les membranes ont été lavées avec le TBST et incubées soit avec l’anticorps N- terminal, C-terminal, anti-AKAP3 ou anti-AKAP4 pendant 16 h à 4°C. Les membranes ont été lavées à cinq reprises avec le TBST et ont ensuite été incubées avec un anticorps secondaire contre les IgG de souris ou de lapin couplé à la peroxydase de raifort (GE Healthcare Bio-Sciences Inc., Baie-d’Urfé, QC) pendant 1 h à la température ambiante. Après de multiples lavages dans le TBST, les bandes immunoréactives ont été détectées avec la trousse ECL Clarity Chemiluminescence Kit (Bio-Rad) et avec le système ChemiDoc (MP Imaging, Bio-Rad).
Immunoprécipitation des complexes à haut poids moléculaire contenant
SPAM1
Afin d’identifier les protéines composant les complexes multiprotéiques dont SPAM1 fait partie, nous avons procédé à une immunoprécipitation à l’aide de l’anticorps dirigé contre la portion C-terminal de SPAM1. Dans un premier temps, les protéines solubilisées des spermatozoïdes suivant la fixation au formaldéhyde ont été précipitées afin de les
concentrer et de diminuer le pourcentage du SDS avant l’immunoprécipitation. Quatre volumes de méthanol et un volume de chloroforme ont été ajoutés aux protéines fixées ou non-fixées (contrôles). La précipitation a eu lieu à −80°C pendant 1 h. Trois volumes d’eau ont été ajoutés au mélange, qui a ensuite été centrifugé à 18000 x g pendant 10 min à 4°C. La fraction aqueuse supérieure a été aspirée et quatre volumes de méthanol ont été ajoutés aux fractions intermédiaires et inférieures, qui ont été vigoureusement mélangées. Les protéines ont été culotées par centrifugation à 18000 x g pendant 10 min à 4°C. Le culot de protéines séché a été remis en suspension avec une solution de SDS 1% contenant des inhibiteurs de protéases (10 μg/mL pepstatine A, aprotinine et leupeptine et 250 μM de PMSF). Les protéines concentrées ont été diluées (1/25) dans du tampon d’immunoprécipitation (1% Triton X-100, 0,5% NP-40, 150 mM NaCl, 10 mM Tris HCl pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 10 μg/mL pepstatine A, aprotinine et leupeptine et 250 μM de PMSF) afin d’obtenir une concentration finale de 0,04% SDS.
Les protéines ayant une affinité non-spécifique aux anticorps de lapin ont été retirées du lysat par incubation avec 5 μg d’immunoglobulines de lapin (rIgG) pendant 1 h à 4°C avec rotation. Des billes de sépharose couplées à la protéine G (Amersham, Uppsala, Sweden) ont été ajoutées et l’incubation a continué pendant une deuxième heure à 4°C avec rotation. Les billes ont été récupérées par centrifugation (4500 x g, 3 min, 4°C) et lavées à trois reprises par centrifugation (4500 x g, 3 min, 4°C) avec le tampon d’immunoprécipitation froid. Les protéines associées aux billes ont ensuite été éluées avec du tampon d’échantillon par chauffage à 99°C pendant 5 min, tandis que le surnageant a été incubé pendant 16 h à 4°C avec rotation avec l’anticorps polyclonal C-terminal (7 μg IgG). Les billes de sépharose couplées à la protéine G ont été ajoutées au lysat et l’incubation a continué pendant 2 h supplémentaires. Les billes ont été récupérées par centrifugation 4500 x g, 3 min, 4°C. Une aliquote du surnageant a été récupérée, mélangée avec du tampon d’échantillon et chauffée à 99°C pendant 5 min. Les billes ont été lavées à trois reprises par centrifugation (4500 x g, 3 min, 4°C) avec le tampon d’immunoprécipitation froid. Les protéines éluées des immunoprécipitations avec les rIgG et l’anticorps C- terminal, ainsi que ceux du surnageant ont été séparés par SDS-PAGE sur un gel à gradient 5 à 10%. Elles ont ensuite été transférées sur membrane PVDF pour l’immunobuvardage tel
que décrit précédemment afin de confirmer la présence des complexes après immunoprécipitation. Deux méthodes ont été utilisées pour analyse LC-MS/MS. Les protéines couplées aux billes ont été éluées avec du tampon d’échantillon par chauffage à 99°C pendant 5 min, séparées par SDS-PAGE, colorées au bleu de Coomassie G-250 et une portion du gel contenant les protéines a été découpée pour l’analyse LC-MS/MS. Alternativement, les protéines couplées aux billes ont été lavées trois fois avec 1 mL 25 mM [NH4]HCO3 et gardées à −20°C jusqu’à l’analyse LC-MS/MS.
Analyse protéomique
L’analyse protéomique a été faite au centre de protéomique du centre de recherche (Plateforme protéomique du Centre de génomique de Québec; Québec, QC, Canada). Pour les protéines découpées du gel de polyacylamide : les protéines ont été réduites avec 10 mM DTT et alkylées avec 55 mM d’iodoacétamine. La digestion par la trypsine a été réalisée avec 126 mM de trypsine porcine modifiée (Promega, Madison, WI) à 37°C pendant 18 h. Les produits de la digestion ont été extraits avec 1% d’acide formique et 2% d’acétonitrile ensuite 1% d’acide formique et 50% d’acétonitrile. Les extraits ont été mis en commun, séchés sous vide et mis en suspension dans 10 μL d’acide formique 0,1% et analysé par spectrométrie de masse.
Pour les billes lavées avec le bicarbonate d’ammonium : les protéines accrochées aux billes ont été remises en suspension dans 25 μL de bicarbonate d’ammonium (50 mM). Les protéines ont été digérées avec 1 μg de trypsine à 37°C pendant 16 h. La digestion par la trypsine a été arrêtée par acidification avec de l’acétonitrile 3%, de l’acide trifluoroacétique 1% et de l’acide acétique 1%. Les billes ont été culotées par centrifugation. Ensuite, les peptides ont été récupérés du surnageant avec un embout spécialisé (Stage Tip C18) et séchés sous vide avant l’injection pour l’analyse. L’échantillon a été solubilisé dans 10 μL d’acide formique 0,1% et analysé par spectrométrie de masse.
Les peptides ont été séparés par chromatographie liquide-capillaire à l’échelle nanométrique en phase inverse (nanoLC) et analysés par spectrométrie masse à
électronébulisation (ES-MS/MS). Les expériences ont été réalisées avec l’appareil Ekspert NanLC425 (Eksigent) couplé à un spectromètre de masse 5600+ (AB Sciex, Framingham, MA, É-U) et équipé avec une source d’ions pour l’électronanonébulisation. La séparation des peptides a été faite sur des colonnes PicoFrit (Reprosil 3u, 120A C18, 15 cm x 0,075 mm diamètre interne). Les peptides ont été élués avec un gradient linéaire de 5 à 35% du solvant B (acétonitrile et acide formique 0,1%) dans 35 min et à 300 nL/min. La masse des spectres a été évaluée en utilisant le mode d’acquisition des données dépendantes avec le programme Analyst (version 1.7). Chaque balayage complet d’un spectre (400 à 1250 m/z) était suivi par la dissociation induite par collision des 20 ions les plus intenses. L’exclusion dynamique a été établie pendant 3 s et avec une tolérance de 100 ppm.
Les fichiers MDF peak ont été créés utilisant le programme Protein Pilot (version 5.0; Sciex). Ces fichiers ont été analysés avec le programme Mascot (Matrix Science, London, UK; version 2.5.1) en recherchant dans la base de données Bos taurus en supposant la digestion enzymatique par la trypsine. La recherche a aussi été faite avec une tolérance de la masse des fragments d’ion de 0,60 Da et une tolérance d’ion parentale de 10,0 ppm.
Scaffold (version Scaffold 4.7.3, Proteome Software Inc., Portland, OR) a été utilisé pour valider l’identité des peptides et des protéines. L’identification des peptides était acceptée si une confiance de plus de 95% pouvait être établie par l’algorithme Peptide
Prophet (Keller et al., 2002). L’identification des protéines était acceptée si une confiance
de plus de 95% pouvait être établie et plus de deux peptides étaient identifiés. L’algorithme
Protein Prophet (Nesvizhskii et al., 2003) a été utilisé pour déterminer la confiance des
protéines.
Immunodétection d’AKAP4 chez les spermatozoïdes bovins
Les spermatozoïdes éjaculés ont été préparés comme décrit précédemment. Les spermatozoïdes ont été mis en suspension à une concentration de 20 x 106 spermatozoïdes par mL. Un volume de 35 μL de cette suspension a été déposé sur une lame préalablement traitée avec la poly-L-lysine puis incubé pendant 30 min à la température ambiante. Les
spermatozoïdes sur les lames ont été fixés avec du formaldéhyde 3,7% (dans PBS) pendant 15 min, lavés trois fois avec du PBS et perméabilisés avec du Triton X-100 (0.2%) pendant 15 min. Les sites non spécifiques ont été bloqués avec du PBS contenant de l’albumine de sérum bovin (BSA 1% p/v). Par la suite, les spermatozoïdes fixés et perméabilisés ont été incubés pendant 16 h à 4°C avec 5 μg/mL d’IgG de souris (contrôle négatif) ou de l’anticorps primaire anti-AKAP4. Après trois lavages avec du PBS, les spermatozoïdes ont été incubés 1 h à la température ambiante avec un anticorps secondaire contre les IgG de lapin et couplé à la fluorescéine isothiocyanate (FITC). Les spermatozoïdes ont été lavés à trois reprises avec du PBS, ensuite des lamelles ont été fixées aux lames utilisant le milieu de montage VectaShield contenant du 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) afin de colorer les noyaux. Les spermatozoïdes ont été visualisés par microscopie en épifluorescence sous UV.
4.3 Résultats
SPAM1 fait partie de plusieurs complexes de haut poids moléculaire
Afin d’optimiser le protocole, plusieurs conditions de chacune des étapes ont été testées. Dans l’article décrivant le protocole de fixation de Klockenbusch et Kast (2010), différents pourcentages de formaldéhyde ont été utilisés afin de déterminer lequel permettait l’obtention des complexes tout en minimisant la perte de la protéine d’intérêt qui demeure sous forme « monomérique » et la perte des protéines totales. Nous avons tenté des pourcentages de 0,4, 1 et 2% formaldéhyde, pour conclure que 1% résultait en la perte minimale de la forme monomérique de SPAM1, tout en conservant les complexes (Figure 4-1). L’équipe de Klockenbusch et Kast (2010) a essayé différentes températures de chauffage pour la solubilisation. Ils ont déterminé que le chauffage à 37°C pendant 30 min permettait de garder les complexes intacts alors que le chauffage à 65 (12 min) ou 99°C (5 min) générait une dissociation et une perte des complexes. Nous avons essayé ces trois températures et nous avons conclu qu’aucune ne générait une perte élevée des complexes, tel que décrit dans l’article. Par contre, 37°C pendant 30 min a été choisi, car les autres températures engendraient tout de même une faible perte des complexes (Figure 4-1). Autres paramètres qui ont été testés sont : durée de fixation (2, 5 et 10 min), concentration de DTT (2 mM et 50 mM) et tampons d’extraction (tampon d’échantillon, tampon n- dodécyl-D-maltoside (DDM) et tampon d’analyse de radioimmunoprécipitation (RIPA)).Suivant la fixation, les protéines ont été séparées par SDS-PAGE et détectées par les anticorps N- et C-terminaux. Si SPAM1 est bien en complexe avec d’autres protéines, nous devrions s’attendre à voir SPAM1 sous forme « monomérique » au poids moléculaire habituel (à ~80 à 85 kDa, selon l’anticorps N- ou C-terminal) ainsi qu’une ou plusieurs formes au-delà de 80 kDa. En premier lieu, la forme monomérique détectée par les deux anticorps est au poids moléculaire habituel et attendu. De plus, plusieurs complexes d’un haut poids moléculaire sont détectés avec les anticorps N- et C-terminaux (Figure 4-2). De façon intéressante, les complexes détectés avec les deux anticorps ne sont pas identiques, mais il y a toutefois plusieurs complexes en commun (Figure 4-2).
Figure 4-1 Immunodétection des complexes obtenus après différentes conditions de fixation et de solubilisation. L’équivalent de 2 x 106 spermatozoïdes ont été déposés par puits. Différents pourcentages de formaldéhyde ont été utilisés (0, 0,4, 1 et 2%) et pour chaque condition de fixation, la solubilisation a été chauffée à soit 37°C (30 min), 65°C (12 min) ou 99°C (5 min). Les flèches noires indiquent les formes monomériques de SPAM1. Toutes les autres bandes sont les complexes détectés par l’anticorps N-terminal (image du haut) ou par l’anticorps C-terminal (image du bas).
Figure 4-2 Complexes multiprotéiques dont SPAM1 fait partie. Complexes détectés avec l’anticorps N-terminal (image de gauche) et l’anticorps C-terminal (image de droite) de contrôles non-fixés (NF) et des les spermatozoïdes fixés (F) (20 μg par puits). SPAM1 est indiquée avec les flèches noires, alors que les complexes détectés par les deux anticorps sont indiqués en rouge, les complexes uniquement détectés par l’anticorps N-terminal en vert et, en bleu, les complexes uniquement détectés par l’anticorps C-terminal.
Identification des partenaires potentiels de SPAM1
La présence des complexes multiprotéiques contenant SPAM1 a été confirmée par immunobuvardage avec les anticorps N- et C-terminaux après immunoprécipitation avec l’anticorps C-terminal. Bien que les complexes détectés par l’anticorps C-terminal soient bien détectés, il est intéressant de noter que les complexes détectés par l’anticorps N- terminal avant immunoprécipitation sont faiblement détectés après l’immunoprécipitation. Les complexes détectés par l’anticorps C-terminal ont été immunoprécipités et analysés par spectrométrie de masse afin d’identifier les protéines composant ces complexes.
Figure 4-3 Immunodétection des complexes formés par SPAM1 après immunoprécipitation. Immunodétection par l’anticorps N-terminal (gauche) et C-terminal (droite). Les fractions non-fixées (NF) et fixées (F) immunoprécipitées avec les IgG de lapin (Pré-cl) sont montrées, de même que les protéines du surnageant non- immunoprécipitées (Non-IP) et celles immunoprécipitées (IP). Les protéines des spermatozoïdes (Spz totaux; l’équivalent de 2 x 106 spermatozoïdes) ont été utilisées comme contrôles positifs pour la forme « monomérique » de SPAM1, et le contrôle positif des complexes avant immunoprécipitation est indiqué (Ctrl (+)). Flèches bleues indiquent les IgG, les flèches noires indiquent les formes monomériques de SPAM1 et les flèches rouges indiquent les complexes détectés par les deux anticorps.
De nombreuses protéines ont été identifiées par LC-MS/MS. Considérant la perte de protéines des échantillons fixés, il est attendu que le nombre de peptides dans l’échantillon fixé soit plus faible que le nombre dans l’échantillon contrôle non-fixé. Afin de pouvoir