Chapitre 3 PH-20 : une homologue de SPAM1 présente dans les spermatozoïdes de
3.2 Matériels et méthodes
Caractérisation de la séquence PH-20 et comparaison avec SPAM1
L’identité et la similarité des séquences nucléotidiques et protéiques de PH-20 (no. d’accès : XP_002686960) et SPAM1 (no. d’accès : AAI10184) ont été évaluées en utilisant le logiciel LALIGN version 36.3.7b (Huang et Miller, 1991). Les sites potentiels de glycosylation ont été identifiés avec le programme GlycoEP (http://www.imtech.res.in/raghava/glycoep/) (Chauhan et al., 2013). La présence d’un peptide signal et d’un domaine transmembranaire ont été évaluées avec les programmes SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) (Petersen et al., 2011) et TMpred (http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html) (Hofmann et Stoffel, 1993), respectivement.
Isolement de l’ARN
Les tissus bovins ont été obtenus d’un abattoir local, coupés en petits morceaux mesurant 0,5 cm x 0,5 cm x 0,5 cm et entreposés à −80°C jusqu’à leur utilisation. L’ARN total a été extrait des tissus testiculaires et épididymaires (tête et queue) utilisant la trousse
RNeasy Mini Kit (Qiagen, Toronto, ON) en suivant le protocole du fabricant. Après la
vérification de l’intégrité de l’ARN sur gel d’agarose, l’ARN total a été traité avec la RQ1 RNase Free DNase I (Promega, Madison, WI), afin d’éliminer toute trace d’ADN, puis purifié utilisant la trousse RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen).
Transcription inverse de l’ARN
Pour produire l’ADN complémentaire (ADNc), 1 μg d’ARN traité à la DNase I des trois tissus a été ajouté à 1,06 μM de l’amorce adaptatrice 3’-RACE (FirstChoice RLM- RACE Kit Invitrogen, Life Technologies, Burlington, ON, Canada), 40 U RNasin (Promega) et 200 U de la transcriptase inverse SuperScript III (Invitrogen, Life Technologies) et de l’eau dépourvue de nucléases pour un volume final de 20 μL.
Réaction en chaîne par polymérase (PCR) du transcrit Ph-20
La vérification de la présence du transcrit Ph-20 dans les tissus bovins a été effectuée par deux séries d’amplifications subséquentes (série primaire et série secondaire). Le mélange réactionnel pour l’amplification de Ph-20 contenait 0,3 mM des amorces sens PH20-for2 (série primaire) ou PH20-for3 (série secondaire) et anti-sens PH20-rev2 (série primaire) ou PH20-rev3 (série secondaire), 1 U de la polymérase Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Ambion, LifeTechnologies) et 1 μL d’ADNc provenant du testicule, de la tête ou de la queue de l’épididyme dans un volume final de 50 μL. Les cycles PCR étaient : un cycle de dénaturation à 94°C pendant 2 min, 35 cycles de dénaturation à 94°C pendant 15 s, d’hybridation à 57°C (série primaire) ou 62°C (série secondaire) pendant 30 s et d’élongation à 68°C pendant 2 min, et un cycle d’élongation final à 68°C pendant 7 min.
Le mélange réactionnel pour l’amplification de la séquence codante de Ph-20 contenait 0,3 mM des amorces sens PH20-for1 et anti-sens PH20-rev1, 1 U de la polymérase Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity et 1 μL d’ADNc provenant du testicule. Les cycles d’amplifications étaient : un cycle initial de dénaturation à 94°C pendant 2 min, suivi par 40 cycles de dénaturation à 94°C pendant 15 s, d’hybridation à 57°C (2 premiers cycles) et 59°C (38 cycles subséquents) pendant 30 s et d’élongation à 68°C pendant 2 min et un cycle final d’élongation à 68°C pendant 7 min.
Les séquences des amorces sont indiquées au Tableau 3-1 et la localisation des amorces le long du transcrit prédit Ph-20 est démontrée à la Figure 3-2.
Tableau 3-1 Séquences des amorces utilisées pour les amplifications de Ph-20. Les sites de restriction des amorces pour l’insertion directionnelle de Ph-20 sont soulignés. L’amorce PH20r-FW1 possède le site pour XhoI et l’amorce PH20r-RV1 possède le site pour BamHI.
Amorces Séquences (5’ → 3’)
adaptateur 3’-RACE GCG AGC ACA GAA TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGT12VN
PH20-for1 GGA ATG CTA AGG CAC CAG CA
PH20-for2 CCA ACT AAC CAT TGT GCT GAA A
PH20-for3 AGA GGC TAC CAA GAG AGC GA
PH20-rev1 ACA TAA AAC ATG CAG ATA GGA AAC C
PH20-rev2 TTA ATA GTT TGT TTC ATT TTT AAT GTT TTG
PH20-rev3 CCT TTG GAT GGT GTT GGA GAG
PH20r-FW1 GTA ACT CGA GCT AAG GCA CCA GCA TA
PH20r-RV1 GTC ACG GAT CCT CTT AAT AGT TTG TTT CAT TTT TAA TGT T
Figure 3-2 Localisation des amorces utilisées le long du transcrit putatif Ph-20. Figure créée utilisant le programme IBS (Liu et al., 2015).
Préparation du vecteur d’expression pET-16b
Le vecteur d’expression pET-16b comporte plusieurs caractéristiques pour l’expression et la purification des protéines recombinantes (Figure 3-3). D’abord, il y a de nombreux sites de restriction permettant la ligature directionnelle de l’amplicon d’intérêt dans le vecteur ainsi qu’une séquence encodant une étiquette poly-histidine (His-tag) en N- terminal de la protéine pour la purification.
Figure 3-3 Carte du vecteur d’expression pET-16b. Les sites de restriction ainsi que la localisation de l’étiquette poly-histidine sont indiqués en jaune. Figure tirée du site
http://www.emdmillipore.com/CA/en/product/pET-16b-DNA---Novagen,EMD_BIO- 69662 (15 avril 2017).
De 5 à 50 μg du vecteur pET-16b a été digéré avec entre 20 U-50 U de chacune des enzymes BamHI (New England Bioabs, Ipswich, MA) et XhoI (NEB) pendant 3 h à 37°C. Pendant la dernière heure, 10 U de phosphatase alcaline intestinale de veau (CIP; NEB) a été ajoutée pour déphosphoryler les extrémités digérées afin d’éviter la fermeture du vecteur. Le vecteur digéré a été récupéré et purifié soit par l’utilisation des colonnes EZ-10
Spin Column PCR Purification Kit (BioBasic, Markham, ON, Canada) ou par extraction
phénol/chloroforme et précipitation par éthanol.
Préparation du transcrit Ph-20 pour l’insertion directionnelle dans le
vecteur d’expression pET-16b
L’insertion du transcrit Ph-20 de façon spécifique dans le vecteur d’expression pET- 16b est importante afin de respecter le cadre de lecture du vecteur et permettre aux
bactéries d’exprimer la protéine. Deux amorces spécifiques pour Ph-20 ont été conçues avec les sites de restriction XhoI (en 5’) et BamHI (en 3’) (Tableau 3-1), aussi retrouvés dans le vecteur pET-16b. Le mélange réactionnel pour l’amplification contenait 0.3 mM des amorces sens PH20r-FW1 et anti-sens PH20r-RV1, 3.75 U d’ADN polymérase (Expand Long Template PCR System, Roche Applied Science, Laval, QC) et 1 μL du transcrit complet de la séquence codante de Ph-20 obtenu par PCR. Les cycles d’amplification étaient comme suit : un cycle de dénaturation à 94°C pendant 2 min, suivi par 37 cycles de dénaturation à 94°C pendant 15 s, d’hybridation à 54°C (2 cycles) et 63°C (35 cycles subséquents) pendant 30 s et d’élongation à 68°C pendant 2 min, et un cycle final d’élongation à 68°C pendant 7 min. L’amplicon Ph-20 avec les extensions contenant les sites de restriction est ainsi nommé Ph-20r. En préparation pour la ligature directionnelle, Ph-20r a été digéré (en même temps que pET-16b, voir ci-haut) par les enzymes BamHI et XhoI afin de créer des bouts complémentaires au vecteur pET-16b digéré. Ph-20r a été purifié par colonne utilisant la trousse EZ-10 Spin Column PCR
Purification Kit (BioBasic).
Ligature directionnelle de Ph-20r dans le vecteur pET-16b et
transformation dans cellules DH5α
L’amplicon Ph-20r, digéré et purifié, a été inséré dans le vecteur pET-16b digéré utilisant 3 U de la ligase d’ADN T4 (Promega) et une incubation de 16 h à 4°C. Le vecteur pET-16b contenant l’insert Ph-20r a ensuite été transformé dans les bactéries DH5-α pour des fins d’amplification du plasmide. Les bactéries ont été étalées sur des pétris contenant de l’ampicilline (50 μg/mL final). Après 16 à 18 h d’incubation à 37°C, les colonies ont été sélectionnées et mises dans le milieu LB liquide (Luria Broth; Sigma Aldrich, Oakville, ON) contenant l’ampicilline (50 μg/mL). L’incubation à 37°C a continué pendant 16 à 18 h avec agitation. Les plasmides des bactéries ont été isolés utilisant la trousse EZ-10 Spin
Column Plasmid DNA Kit (BioBasic) et la séquence de l’insert Ph-20r a été vérifiée par
Expression de la protéine recombinante PH-20
Les plasmides pET-16b contenant l’insert Ph-20r ont été transformés dans les bactéries d’expression (BL21-Codon plus Competent Cells; Agilent Technologies, Mississauga, ON) en suivant le protocole du fabricant. Les bactéries ont été étalées sur des pétris contenant les antibiotiques ampicilline (50 μg/mL) et chloramphénicol (34 μg/mL) et incubées à 37°C pendant 16 à 18 h. Le lendemain, les colonies ont été ensemencées dans 5 mL du milieu LB liquide supplémentés d’ampicilline et de chloramphénicol et a été incubé à 37°C pendant 16 à 18 h avec agitation. Une aliquote de cette culture bactérienne a été ensemencée dans deux tubes avec 5 mL LB liquide avec les mêmes concentrations d’antibiotiques et incubés pendant 16 à 18 h à 37°C avec agitation. Afin d’induire la transcription, 1 mM d’isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG; Sigma Aldrich) a été ajouté et l’incubation avec agitation s’est poursuivie pendant 45 min à 30°C. Un tube a été centrifugé pour récupérer le culot cellulaire et le conserver à −80°C. Une aliquote du deuxième tube a servi pour la vérification de la présence de la protéine PH-20 dans la fraction totale. Le restant de la culture bactérienne du deuxième tube a été centrifugé (3000 rpm, 30 min, 4°C) pour récupérer le culot de bactéries. Le culot a été remis en suspension avec 800 μL du tampon de liaison (20 mM Na2HPO4, 500 mM NaCl, 30 mM imidazole, 1 mM MgCl2 et 10 μg/mL des inhibiteurs de protéase pepstatine A, aprotinine et leupeptine et 250 μM de PMSF). Ensuite, 10 μg de RNase A et 5 μg de DNase I ont été ajoutés. Les bactéries ont été lysées par traitement aux ultrasons. Après 20 min sur glace, le lysat a été centrifugé à 18000 x g pendant 30 min à 4°C. Du tampon d’échantillon 2X (125 mM Tris HCl pH 6.8, 20% glycérol, 100 mM DTT, 4% SDS et 0.1% bromophénol bleu) a été ajouté à une aliquote du surnageant et au culot. Ces deux composantes ont été chauffées à 99°C pendant 5 min. Le surnageant restant a été utilisé pour la purification de PH-20rec.
Purification de la protéine recombinante PH-20r
Du Triton X-100 (1% final) a été ajouté au surnageant et le mélange a été incubé sur glace pendant 15 min. Environ 40 μL de billes sépharose avec ions Ni2+ (Ni-Sepharose 6 Fast Flow, GE Healthcare), permettant de lier la protéine PH-20rec par l’intermédiaire de son étiquette poly-histidine, a été ajouté au surnageant. Le mélange surnageant-billes a été
incubé pendant 30 min à la température ambiante avec rotation. Les billes ont été récupérées par centrifugation et lavées à trois reprises avec du tampon de lavage (20 mM Na2HPO4, 1,5 M NaCl, 30 mM imidazole, 1% Triton X-100 et 10 μg/mL des inhibiteurs de protéase pepstatine A, aprotinine et leupeptine et 250 μM de PMSF). Par la suite, du tampon d’échantillon 2X a été ajouté aux billes lavées pour récupérer la protéine PH-20 recombinante.
Anticorps
Nous avons deux anticorps qui reconnaissent la protéine SPAM1. Le premier est un anticorps monoclonal produit à partir d’une culture d’hybridomes (American Type Culture Collection, Manassa, VA). Dans les spermatozoïdes bovins, cet anticorps reconnaît spécifiquement la région N-terminal de la protéine SPAM1 (Figure 3-1) (Lalancette et al., 2001; Morin et al., 2005; Morin et al., 2010). Cet anticorps sera nommé l’« anticorps N- terminal ». Le deuxième anticorps est un anticorps polyclonal dirigé contre les acides aminés 535 à 550 de la région C-terminale de SPAM1 bovine (longueur totale de 553 AA) (no. d’accès : AAI10184.1). Puisqu’il reconnaît la région C-terminale, il sera nommé l’« anticorps C-terminal ». L’anticorps monoclonal anti-His-tag (contre l’étiquette poly- histidine) provient de GE Healthcare Bio-Sciences Inc. (Baie d’Urfé, QC).
Détection de PH-20rec par coloration à l’argent et immunobuvardage
La présence de la protéine PH-20rec a été investiguée par coloration à l’argent des protéines et par immunobuvardage. Suivant l’électrophorèse, les protéines ont été soit colorées à l’argent ou transférées sur membrane PVDF en utilisant le système Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad, Mississauga, ON, Canada). Les sites non-spécifiques de la membrane PDVF ont été bloqués avec du lait écrémé 5% (p/v) dans une solution saline tamponnée avec du Tris et contenant du Tween (TBST; 150 mM NaCl, 20 mM Tris HCl pH 7.4 et 0.1% (v/v) Tween 20) pendant 2 h à la température ambiante. Ensuite, les membranes ont été lavées avec le TBST et incubées avec soit l’anticorps monoclonal anti- His-tag, l’anticorps monoclonal N-terminal ou l’anticorps polyclonal C-terminal pendant 16 heures à 4°C. Les membranes ont été lavées à cinq reprises avec le TBST et ont ensuiteété incubées avec un anticorps secondaire couplé à la peroxydase de raifort dirigé contre les IgG de souris ou de lapin (GE Healthcare Bio-Sciences Inc.) pendant 1 h à la température ambiante. Après de multiples lavages dans le TBST, les bandes immunoréactives ont été détectées avec la trousse ECL Clarity Chemiluminescence Kit (Bio-Rad) et avec le système ChemiDoc (MP Imaging, Bio-Rad).
Insertion de l’amplicon Ph-20r dans un vecteur de clonage et séquençage
Cette section décrit une méthode alternative pour la production de l’insert Ph-20r utilisée après l’échec initial de la production de la protéine PH-20rec. Après l’amplification de la séquence codante au complet de Ph-20 pour ajouter les sites de restriction reconnus par BamHI et XhoI, l’amplicon Ph-20r a été inséré dans le vecteur pGEM-T Easy (Promega) et ces plasmides ont été transformés dans les bactéries DH5α compétentes (NEB) en suivant le protocole du fabricant. Les colonies positives ont été sélectionnées par criblage bleu/blanc par la présence du 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) sur les pétris. Les bactéries sans l’insert Ph-20r produisent des colonies bleues puisque le gène lacZ demeure intact et produit l’enzyme β-galactosidase. Cette enzyme peut cliver le X-gal, ce qui produit un pigment insoluble bleu. Les bactéries avec l’insert Ph-20r produisent des colonies blanches, car le gène lacZ est coupé par la présence du transcrit et ne peut donc pas produire l’enzyme β-galactosidase. Les plasmides issus des colonies positives ont été isolés avec la trousse EZ-10 Spin Column Plasmid DNA Kit (BioBasic). Les clones ont été séquencés au centre de séquençage de notre centre de recherche (Plateforme de séquençage et de génotypage des génomes, Québec, QC). Les séquences ont été identifiées et validées utilisant le programme BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) et en faisant les recherches dans la base de données Bostaurus. Afin de préparer l’insert Ph-20r pour la ligature directionnelle dans le vecteur pET-
16b, l’insert a été obtenu suite à la digestion du plasmide par les enzymes BamHI et XhoI et purifié par migration sur gel d’agarose. La bande correspondant à l’insert a été découpée du gel d’agarose et purifié par colonne (EZ-10 Spin Column Gel Extraction Kit; BioBasic). Cet insert a ensuite été ligaturé dans le vecteur pET-16b digéré, tel que décrit plus haut.