Depuis les années 1940, il est proposé que les hyaluronidases ont un rôle dans la fécondation, et plus précisément dans la dispersion des cellules du cumulus oophorus par leur capacité d’hydrolyser l’acide hyaluronique (Hechter et Hadidian, 1947). Il y a cinq gènes encodant pour des hyaluronidases chez la souris et six chez l’humain (Csoka et al., 2001; Martin-Deleon, 2011). Étant donné que les hyaluronidases sont nombreuses chez les spermatozoïdes des mammifères et que l’invalidation de l’un ou l’autre n’affecte pas la fertilité des souris, il est soupçonné que les hyaluronidases auraient des fonctions redondantes et compensatrices (Miller et al., 2006). Par exemple, les souris ayant une délétion du gène encodant PH-20 (SPAM1) retiennent leur fertilité, mais une dispersion plus lente des cellules du cumulus par les spermatozoïdes est observée (Baba et al., 2002; Kim et al., 2005). À la lumière de ces résultats, il a été suggéré que plusieurs hyaluronidases existent et seraient capables de disperser les cellules du cumulus oophorus assurant la pénétration de celui-ci pour permettre le contact entre le spermatozoïde et la ZP.
Cependant, une étude a démontré que l’arylsulfatase A pouvait disperser le cumulus, car l’inhibition des hyaluronidases avec l’apigénine avait comme effet une dispersion lente du cumulus, sans affecter la fertilité des souris (Wu et al., 2007). Ceci démontre que d’autres protéines pouvant disperser le cumulus existent, comme l’arylsulfatase A, ce qui renforce le concept de redondance pour le processus de la dispersion du cumulus.
1.5.1 PH-20 (SPAM1) : les débuts
L’hyaluronidase la mieux caractérisée chez plusieurs espèces est SPAM1, anciennement connue sous le nom PH-20, et dont fait l’objet de ce mémoire. Dans les années 1980, des expériences utilisant des préparations de membranes de spermatozoïdes de cobayes ont été faites afin de produire des anticorps monoclonaux. Les anticorps ont été criblés selon la reconnaissance des régions du spermatozoïde. Sept anticorps reconnaissaient la région post-acrosomale (PH; posterior head), dont PH-20, le 20e clone (Primakoff et Myles, 1983). Toujours chez le cobaye, une population de PH-20 se situe dans la région post-acrosomale, mais après la réaction acrosomale, elle migre pour rejoindre une deuxième population sur la membrane interne de l’acrosome (Myles et Primakoff, 1984; Cowan et al., 1987; Cowan et al., 1991). Suivant la découverte de la relocalisation de cette protéine avant et après la réaction acrosomale, Primakoff et al. (1985) ont proposé que PH-20 ait un rôle dans les interactions spermatozoïde-zone pellucide. Lorsque les spermatozoïdes ayant subi la réaction de l’acrosome sont incubés avec les anticorps contre la région C-terminale de PH-20, une inhibition de la liaison des spermatozoïdes à la zone pellucide est observée, démontrant que le domaine C-terminal de PH-20 serait impliqué dans les interactions spermatozoïde-ZP (Primakoff et al., 1985; Myles et al., 1987; Hunnicutt et al., 1996). Ceci a exposé un rôle potentiel dans l’immunocontraception. Malgré le succès de la contraception utilisant PH-20 purifiée chez le cobaye, l’immunisation des lapins et des souris avec la protéine recombinante PH-20 n’a pas été efficace comme méthode de contraception (Primakoff et al., 1988b; Pomering et al., 2002; Hardy et al., 2004). À la lumière de ce problème chez ces espèces, l’intérêt pour cette protéine dans la contraception a depuis beaucoup diminué.
En 1993, une homologie a été découverte entre l'hyaluronidase du venin d’abeille et le domaine N-terminal de la protéine PH-20 (Gmachl et Kreil, 1993). En sachant que l’acide hyaluronique est un composé majeur du cumulus oophorus, il était particulièrement intéressant de déterminer si PH-20 possédait en fait une activité hyaluronidase qui pouvait participer à la dispersion des cellules du cumulus. Des essais enzymatiques ont révélé que PH-20 de plusieurs espèces avait bel et bien une activité hyaluronidase soit au pH 4 ou 7 ou aux deux (Lin et al., 1994; Cherr et al., 1996; Hunnicutt et al., 1996; Sabeur et al., 1997; Morin et al., 2005). La protéine PH-20 possède donc deux fonctions : une activité hyaluronidase et une capacité de liaison à la zone pellucide (Hunnicutt et al., 1996), ce qui a suscité à nouveau un intérêt pour cette protéine, mais surtout pour son rôle dans les interactions entre les gamètes mâles et femelles. Des homologues du gène PH-20 ont été trouvés par Southern Blot chez plusieurs mammifères, dont la souris, le rat, le hamster, le lapin, l’humain, le singe et le taureau (Lathrop et al., 1990). Des orthologues de PH-20 ont ensuite été trouvés chez la souris (Thaler et Cardullo, 1995), le rat (Hou et al., 1996), l’homme (Sabeur et al., 1997), le taureau (Lalancette et al., 2001) et autres mammifères, indiquant la conservation de PH-20 parmi les espèces. PH-20 a un poids moléculaire entre 53 et 68 kDa, selon les espèces, et est ancrée à la membrane plasmique par une ancre GPI (Primakoff et al., 1988a; Phelps et al., 1988; Lathrop et al., 1990; Gmachl et al., 1993; Thaler et Cardullo, 1995; Jones et al., 1995; Hou et al., 1996; Sabeur et al., 1997; Seaton et al., 2000). De plus, PH-20 chez le cobaye possède de nombreux sites de glycosylation et plusieurs résidus cystéines, ce qui suggère qu’il y aurait plusieurs ponts disulfures participant au repliement de la protéine et contribuant à l’activité hyaluronidase (Lathrop et al., 1990; Li et al., 2002).
1.5.2 SPAM1 : Bos taurus
Au courant des années 1990, la nomenclature de PH-20 a changé à SPAM1 (Sperm Adhesion Molecule 1), mais ces deux termes sont encore utilisés de façon interchangeable chez plusieurs espèces. Chez ces espèces, que le terme PH-20 ou SPAM1 soit utilisé, le gène de la protéine est Spam1. La distinction importante à faire chez Bos taurus est que les gènes Spam1 (NCBI Gene ID : 353352) et Ph-20 (NCBI Gene ID : 509761) existent et encodent différentes protéines. De ce fait, dans de ce mémoire, en se référant au taureau,
SPAM1 et PH-20 seront traités comme des termes distincts (deux protéines) et non des synonymes.
Comme chez les nombreuses espèces étudiées, l’activité hyaluronidase de SPAM1 est confiée au domaine N-terminal, tandis que la capacité de liaison à la zone pellucide est retrouvée au domaine C-terminal. Spécifiquement, l’incubation de SPAM1 avec un anticorps bloquant la région C-terminale inhibe le nombre total de spermatozoïdes liés à la ZP par rapport au contrôle IgG, alors que le blocage du domaine N-terminal avec un anticorps n’affecte pas la liaison (Morin et al., 2010). Contrairement aux autres espèces, SPAM1 de Bos taurus est dépourvue d’une ancre GPI, car la protéine ne peut pas être relâchée de la membrane suivant le traitement avec la phospholipase C spécifique à la phosphatidylinositol (PI-PLC) (Lalancette et al., 2001). Il y a une seule autre exception documentée de l’absence d’une ancre GPI pour SPAM1, qui se trouve chez le renard roux (Vulpes vulpes) (ten Have et al., 1998). Chez l’espèce bovine, deux domaines transmembranaires (TM) putatifs ont été détectés après l’analyse de la séquence en acides aminés déduite. Puisque le premier domaine TM est situé dans le peptide signal (36 AA), il est clivé lors de la maturation de la protéine (Morin et al., 2005). Le domaine transmembranaire restant pourrait expliquer comment SPAM1 est lié aux membranes du spermatozoïde. SPAM1 chez plusieurs espèces existe sous différentes formes et a un poids moléculaire entre 53 à 68 kDa. Par exemple, chez l’humain et le macaque, deux formes de PH-20 de 64 et 53 kDa sont retrouvés (Cherr et al., 1996; Sabeur et al., 1997). PH-20 du cobaye a une forme de 64 kDa, une de 56 kDa et une troisième composée de deux fragments liés par des ponts disulfure de 41 à 48 kDa et de 27 kDa (Primakoff et al., 1988a). Chez le taureau, les résultats obtenus par Morin et al. (2010) suggèrent qu’il y a deux isoformes de SPAM1, mais ayant des poids moléculaires plus élevés, soit de ~70 et 80 kDa. Comme chez le cobaye, SPAM1 bovin possède de nombreux sites de N- et d’O- glycosylation ainsi que plusieurs cystéines regroupées en C-terminal. La glycosylation ne semble pas être impliquée dans les interactions spermatozoïde-ZP, car la N- et la O- déglycosylation n’affecte pas le pourcentage de spermatozoïdes liés à la zone pellucide par rapport aux spermatozoïdes contrôles non-déglycosylés (Morin et al., 2005; Morin et al., 2010).