Discussion générale
La quête à mieux comprendre les interactions entre les gamètes pendant le processus de la fécondation est très importante non seulement pour les couples infertiles, mais aussi pour l’industrie de la production animale. La recherche des marqueurs de fertilité (ou d’infertilité) est courante et, compte tenu des implications éthiques des études chez les humains, les modèles animaux sont privilégiés. Bien que les rongeurs soient fréquemment employés comme modèles, le taureau est particulièrement intéressant puisque l’industrie agroalimentaire amasse des milliers de données relatives à la fertilité des taureaux. Grâce à l’insémination artificielle, il n’est pas rare qu’un taureau engendre plusieurs milliers de descendants directs, donnant ainsi beaucoup de précision aux données de fertilité.
D’innombrables protéines sont impliquées dans les diverses étapes de la fécondation. Une de ces protéines est SPAM1, initialement connue sous le nom de PH-20, présente chez les spermatozoïdes. La découverte de cette protéine est attribuée à la recherche d’une protéine qui pouvait être ciblée pour la contraception mâle. Son nom provenait de la localisation sur le spermatozoïde (Posterior Head) et le numéro du clone de l’hybridome générant l’anticorps (20) (Primakoff et Myles, 1983). Depuis sa découverte chez le cobaye au début des années 1980, de nombreuses études ont été réalisées pour sa caractérisation. Des expériences utilisant des anticorps bloquant le domaine C-terminal de PH-20 ont révélé que cette région était impliquée dans la liaison à la zone pellucide de l’ovocyte (Primakoff et al., 1985). Une première fonction a donc été élucidée pour PH-20. Étonnamment, une similarité entre SPAM1 et l’hyaluronidase du venin d’abeille a été trouvée quelques années plus tard (Gmachl et Kreil, 1993). Sachant que le cumulus oophorus de l’ovocyte contient de l’acide hyaluronique, la similarité entre ces deux protéines a mené à une deuxième fonction pour SPAM1 : la dispersion du cumulus oophorus par l’hydrolyse de l’acide hylauronique (HA) (Lin et al., 1993; Gmachl et al., 1993). En outre, bien que peu étudiée,
une troisième fonction de SPAM1 a été identifiée : la signalisation intracellulaire entremise par la liaison de l’acide hyaluronique au domaine de liaison à l’HA. Par contre, cette troisième fonction n’a été étudiée que chez les spermatozoïdes humains et des macaques (Sabeur et al., 1998; Cherr et al., 1999). SPAM1 chez ces espèces est liée à la membrane par une ancre GPI, contrairement à ce qui est retrouvé chez l’espèce bovine (Gmachl et al., 1993; Lin et al., 1994; Lalancette et al., 2001). Puisque les protéines ayant une ancre GPI sont très souvent associées à la signalisation intracellulaire, il se peut que cette fonction soit restreinte chez les espèces où SPAM1 possède ce type d’ancrage. Des orthologues de SPAM1 ont été trouvés dans les spermatozoïdes de plusieurs espèces, démontrant que cette protéine est hautement conservée (Thaler et Cardullo, 1995; Hou et al., 1996; Sabeur et al., 1997; Lalancette et al., 2001). Toutefois, plusieurs autres hyaluronidases ont été découvertes chez ces mêmes espèces. Ces hyaluronidases sont actives à un pH acide ou neutre et ont parfois des rôles complémentaires entre eux, d’où le concept de la redondance chez ce type de protéine. Des invalidations du gène Spam1 chez la souris ont démontré que cette protéine n’était pas essentielle pour la dispersion du cumulus oophorus, mais il y avait un retardement du passage du cumulus par ces spermatozoïdes. Cependant, d’autres études ont conclu que la fonction de digestion de SPAM1 était requise pour l’entrée et le passage du cumulus oophorus. Il y a donc encore des incertitudes quant au rôle de SPAM1 chez les spermatozoïdes de mammifères. C’est pour cette raison que la caractérisation de SPAM1 est importante afin de mieux comprendre son rôle dans les interactions entre les spermatozoïdes et les composantes du gamète femelle.
Tel que discuté au Chapitre 2, SPAM1 chez l’espèce bovine est particulière comparativement à ce qui est retrouvé chez les autres espèces étudiées. D’abord, les isoformes potentielles de SPAM1 ont des poids moléculaires plus élevés, se situant entre 70 et 80 kDa, tandis que chez les autres, SPAM1 a un poids de 64 et 56 ou 53 kDa (Primakoff et al., 1988a; Jones et al., 1996; Morin et al., 2010). En outre, SPAM1 bovine serait dépourvue d’une ancre GPI, laissant la possibilité qu’elle soit liée à la membrane d’une autre façon, potentiellement par un domaine transmembranaire (TM). Des études précédentes effectuées au laboratoire ont mené à l’hypothèse que l’isoforme de 80 kDa (reconnue par les anticorps N- et C-terminaux) serait localisée dans la région acrosomale et
l’isoforme de 70 kDa (reconnue par l’anticorps N-terminal seulement) serait dans la région post-acrosomale, similaire à ce qui avait été rapporté dans les études initiales de PH-20 chez le cobaye, avec son domaine N-terminal orienté vers l’extérieur (Myles et Primakoff, 1984; Morin et al., 2010). Nos études récentes ont permis de confirmer la présence de deux transcrits Spam1 ayant ou non l’exon 3 du gène de Spam1, où l’exon 3 encode un domaine transmembranaire putatif. En plus de confirmer la présence du transcrit long, précédemment trouvé par Morin et al. (2005), ceci démontre pour la première fois la présence d’un transcrit court chez les spermatozoïdes bovins, antérieurement uniquement une séquence prédite dans la base de données NCBI. Alors ces deux transcrits, si traduits, donneraient deux isoformes ayant ou non un domaine TM. Il était incertain si ces deux transcrits correspondent aux deux isoformes potentielles de 70 et 80 kDa de SPAM1. D’une part, le transcrit long (avec l’exon 3) pouvait correspondre à l’isoforme reconnue par les deux anticorps (80 kDa), d’autre part la région 3’ du transcrit court (sans l’exon 3) était identique à celui du transcrit long suggérant que les deux transcrits donneraient des isoformes avec des séquences en acides aminés identiques en C-terminal. Cependant, des domaines C-terminaux identiques ne semblaient pas être le cas pour les isoformes de SPAM1 puisque notre anticorps C-terminal ne reconnaissait qu’une seule des deux isoformes. Puisque SPAM1 est hautement glycosylée (tel que démontré précédemment par Morin et al. (2005; 2010) et dans les travaux présentés dans le Chapitre 2), il était possible que la glycosylation occasionne un masquage du site reconnu par l’anticorps C-terminal sur l’isoforme de 70 kDa. Cependant, après la déglycosylation totale de SPAM1, deux bandes étaient étaient reconnues par l’anticorps N-terminal, alors que l’anticorps C-terminal ne reconnaissait toujours que la bande supérieure (correspondant à l’isoforme plus lourde de 80 kDa déglycosylée) (voir Chapitre 2). Nos études récentes présentées au Chapitre 2 ont confirmé la présence de l’isoforme ayant la séquence encodant le domaine transmembranaire putatif et suggèrent fortement que la deuxième isoforme ne serait pas présente chez les spermatozoïdes. Compte tenu de nos résultats antérieurs et présents, il est possible que SPAM1 n’existe que sous sa forme de 80 kDa et n’ait pas de deuxième isoforme (70 kDa); une question demeure sans réponse : quelle autre protéine reconnaît notre anticorps N-terminal ? Plusieurs réponses potentielles existent. La première est que l’anticorps reconnaît quand même SPAM1, mais que cette protéine subit une modification
post-traductionnelle, telle qu’un clivage protéolytique en C-terminal ou la glycosylation. La glycosylation est exclue de cette première possibilité, car la déglycosylation ne mène pas à la reconnaissance de l’isoforme courte par l’anticorps C-terminal, tel que discuté ci-haut. Une deuxième possibilité est que l’anticorps N-terminal reconnaît une protéine similaire. Le Chapitre 3 discute de l’identification de la présence d’une homologue de SPAM1, ici nommée PH-20. Plusieurs homologues de la protéine hyaluronidase existent, non seulement chez le taureau, mais aussi chez les espèces murines, humaines et autres. En outre, des informations contradictoires existent concernant la fonction des différentes homologues des hyaluronidases. Par exemple, certaines études concluent que SPAM1 est nécessaire pour la digestion du cumulus oophorus (Kimura et al., 2009), alors que d’autres déterminent que SPAM1 est non obligatoire pour la fécondation (Kang et al., 2010) et d’autres encore trouvent qu’une autre hyaluronidase, HYAL5 serait responsable de la pénétration du cumulus (Kim et al., 2005). Chez la souris, une étude a déterminé que la protéine HYAL2 a un rôle redondant pour l’hydrolyse de l’acide hyaluronique dans le cumulus oophorus (Modelski et al., 2014). Étant donné que les domaines N-terminaux de PH-20 et SPAM1 sont très similaires (72,1% d’identité et 90,3% de similarité), il est probable que PH-20 ait une capacité d’hydrolyse de l’acide hyaluronique. Le domaine C- terminal de PH-20, bien que semblable à celui de SPAM1 comporte tout de même des différences au niveau de la séquence (62,5% d’identité et 80,4% de similarité). Il reste à déterminer si les domaines de PH-20 ont des fonctions similaires à ceux de SPAM1. Si l’anticorps N-terminal reconnaît bel et bien l’homologue PH-20, il est très important de la caractériser afin d’élucider son rôle, parmi les nombreuses hyaluronidases. Ceci nous permettra de déterminer si PH-20 possède un rôle redondant ou plutôt un rôle particulier qui pourra nous aider à mieux comprendre la fonction des différentes hyaluronidases dans les interactions entre les gamètes.
Il est non seulement essentiel de mieux comprendre le rôle individuel des protéines, comme SPAM1 ou même PH-20, mais ce qui se passe réellement est très souvent que les protéines travaillent de concert afin de compléter les étapes du processus de la fécondation. Le Chapitre 4 présentait l’identification des partenaires d’interactions potentiels de SPAM1. Chez l’humain, SPAM1 fait partie d’un complexe avec la protéine chaperonne
HSPA2 et l’arylsulfatase A (ARSA), qui peut aussi hydrolyser l’acide hyaluronique (Redgrove et al., 2013). Ce complexe se réoriente pendant la capacitation afin de pénétrer la zone pellucide par l’hydrolyse de la HA par l’ARSA. Cette étude met en évidence un complexe qui sert d’intermédiaire pour les interactions entre les gamètes. Nos études n’ont pas permis d’identifier de tels complexes, mais ont souligné la possibilité de la présence d’une interaction inattendue pour SPAM1. Selon nos résultats, SPAM1 interagirait avec les protéines d’ancrage AKAP3 et AKAP4. La fixation des complexes avec le formaldéhyde et l’identification des protéines par spectrométrie de masse après immunoprécipitation avec l’anticorps C-terminal ont révélé un fort enrichissement de ces protéines. Les AKAPs sont présentes en abondance dans la gaine fibreuse de la pièce principale des spermatozoïdes, mais aussi dans la région post-acrosomale (AKAP4) et possiblement acrosomale (AKAP3; Vijayaraghavan et al., 1999) du spermatozoïde. En immunofluorescence, SPAM1 est localisée dans les régions acrosomales et post-acrosomales du spermatozoïde. Toutefois, des études précédentes ont démontré que SPAM1, détectée par l’anticorps C-terminal, est présente aussi dans le flagelle après incubation des spermatozoïdes. Il y a donc concordance de la localisation de ces protéines, et donc valide le potentiel d’une interaction entre SPAM1 et AKAP3 et AKAP4. Il reste à confirmer si l’interaction est réelle afin de déterminer le rôle et l’implication biologique de ce partenariat chez les spermatozoïdes. Il est connu chez l’humain et le macaque que SPAM1 possède une fonction de signalisation intracellulaire par l’intermédiaire du domaine de liaison à l’acide hyaluronique. La signalisation résultante contribue à la potentialisation de la réaction de l’acrosome. Cependant, cette fonction n’a été rapportée que dans ces deux espèces (Sabeur et al., 1998; Cherr et al., 1999). Il est aussi à noter que SPAM1 chez ces espèces sont ancrées à la membrane par une ancre GPI, contrairement à ce qui est trouvé chez le taureau. Il est connu que les protéines avec ce type d’ancrage sont regroupées dans les radeaux lipidiques, avec d’autres protéines, afin de faciliter la transduction du signal. Les AKAPs rassemblent des composantes qui sont associées à des voies de signalisation, telles que les sous-unités régulatrices de la protéine kinase dépendante de l’AMPc. Considérant la possibilité que SPAM1 chez l’espèce bovine interagisse avec AKAP3 et AKAP4, il se peut que la fonction de signalisation de SPAM1 soit remplie par son association avec ces protéines, et non pas à l’ancre GPI, comme chez l’humain et le macaque. Une étude a démontré que la
phosphorylation d’AKAP3 était associée à une hausse de la motilité (Luconi et al., 2004; Luconi et al., 2005), tandis qu’AKAP4 était associée aux voies de signalisation impliquées dans la capacitation et la réaction de l’acrosome (Carr et Newell, 2007; Fiedler et al., 2008; Rahamim Ben-Navi et al., 2016). Des études, présentées au Chapitre 4, ont confirmé la présence d’AKAP4 dans le flagelle et ont démontré sa présence dans la région post- acrosomale du spermatozoïde. Il serait alors intéressant d’élucider le rôle potentiel qu’a SPAM1 avec AKAP3 ou AKAP4 dans le flagelle ou avec AKAP4 dans la région post- acrosomale. Il est donc possible que SPAM1 ait une fonction nouvelle dans la motilité, ou dans la capacitation et la réaction de l’acrosome. La fonction dans la motilité est intéressante puisque, tel que mentionné plus tôt dans ce chapitre, l’invalidation du gène Spam1 causait un retardement de la pénétration du cumulus oophorus par ces spermatozoïdes. De plus, tel que présenté dans le Chapitre 1, la pénétration du cumulus se fait probablement par une combinaison de l’hydrolyse de l’acide hyaluronique et les mouvements des spermatozoïdes hyperactivés. La pénétration retardée du cumulus observée chez les spermatozoïdes des souris Spam1-/- pourrait être causée non par la perte de la capacité de digestion du cumulus, mais par une déficience de la motilité spermatique requise pour la pénétration. La déficience pourrait être occasionnée par la perte de l’association SPAM1/AKAP3, dans le flagelle et associée à la motilité, ou par SPAM1/AKAP4, dans la région post-acrosomale et associée à la capacitation (et ultimement à l’hyperactivation) et à la réaction de l’acrosome.
Bien que la possibilité d’un nouveau rôle pour SPAM1 soit basée sur des spéculations, il est tout de même intéressant d’imaginer une telle fonction pour une protéine tant caractérisée chez plusieurs espèces. Étant donné des différences entre SPAM1 chez l’espèce bovine et les autres espèces étudiées, il se peut aussi que ce nouveau rôle ne soit présent que chez le taureau. Évidemment, beaucoup de travail reste à compléter avant de conclure que SPAM1 est réellement en complexe avec AKAP3 ou AKAP4 (et même ACRBP et GSTM3, Chapitre 4). Cependant, les études des interactions ainsi que la caractérisation profonde des isoformes de SPAM1 et de son homologue potentielle PH-20 contribuent à une meilleure compréhension du rôle de SPAM1 et comment cette protéine est impliquée dans les interactions entre les gamètes.
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