a. cIEF : choix des conditions initiales
Les analyses ont été réalisées dans un capillaire PVA très utilisé en cIEF des protéines 109,174. En effet, malgré le développement de nombreux protocoles de revêtements, les revêtements commerciaux sont particulièrement appréciés pour leur robustesse et leur reproductibilité lors des analyses cIEF. Le revêtement PVA est obtenu par l’adsorption covalente d’une couche de PVA sur les silanols du capillaire en silice. Il est neutre et hydrophile et permet de réduire le FEO et de limiter l’adsorption des protéines sur la paroi du capillaire. En comparaison à d’autres types de revêtements neutres et permanents tels que le PAA qui n’est stable que sur une gamme de pH restreinte (3-8) et disponible commercialement qu’à un seul diamètre interne de capillaire (50 µm), le capillaire PVA présente une stabilité sur une gamme de pH plus large (2.5-9.5) et est disponible à différents diamètres internes de capillaires (50 µm, 75 µm et 100 µm). L’utilisation de capillaire de diamètre interne plus large permettra d’augmenter la quantité de peptide récupéré dans la solution de catholyte de 5 µL. De plus, il existe une solution de rinçage à base de formamide (AB Sciex) qui a permis d’augmenter considérablement la longévité du capillaire PVA jusqu’à 100 analyses cIEF de protéines 174. Par ailleurs, nous avons choisi de travailler avec le gel cIEF à base de poly(éthylène) glycol fourni par le kit de Beckman et nous avons sélectionné les ampholytes de la famille des pharmalytes à différentes gammes de pH (3-10/ 4.5-6.5/ 5-8) pour optimiser le gradient de pH. En effet, comme expliqué dans le chapitre 3, les pharmalytes présentent par rapport aux autres ampholytes le pourcentage le plus
97 élevé de « bons ampholytes » avec des propriétés en termes de pouvoir tampon et de conductivité élevées 99,110.
Nous nous sommes appuyés sur le tableau 9 qui dresse la liste de quelques anolytes et catholytes couramment utilisés en cIEF afin de choisir les conditions optimales en tenant compte des contraintes liées à la stabilité du revêtement PVA (pH 2.5-9.5) et de l’étape d’immunodétection des fractions de collecte. L’anolyte étant introduit dans le capillaire durant la mobilisation par pression vers le détecteur, cette étape peut dégrader le revêtement PVA. Nous avons d’une part cherché à utiliser une solution d’anolyte avec le pH le moins acide. Notre choix s’est orienté vers la solution d’acide phosphorique (10 mM, pH 2.4) qui permet de travailler à un pH proche de 2.5 en comparaison des autres anolytes de même nature mais de pHs trop acides. D’autre part, étant donné que l’analyse cIEF sera par la suite couplée à une immunodétection, le pH du catholyte ne doit pas dépasser 8.6 au risque de dégrader les anticorps de capture. Les solutions de catholyte à base de soude ayant des pHs très alcalins, d’autres catholytes de nature zwiterionique (MES à pH 8.4 et CAPS à pH 9.6) ont donc été préférés. Le catholyte choisi est donc constitué d’une solution de MES (50 mM, pH 8.4). Ainsi, en utilisant les solutions d’acide phosphorique (10 mM, pH 2.4) et de MES (50 mM, pH 8.4) comme anolyte et catholyte respectivement, nous avons réalisé dans un premier temps la séparation par cIEF de protéines standards ayant des pIs proches de ceux des peptides amyloïdes d’intérêt. Puis, nous avons optimisé d’autres paramètres liés aux ampholytes et additifs du mélange d’échantillon afin d’obtenir une séparation des peptides avec la meilleure résolution dans un capillaire PVA de diamètre interne de 75 µm. Ensuite, la méthode de séparation a été adaptée dans un capillaire de diamètre interne plus large (100 µm) dans le but de réaliser le fractionnement des peptides. Ces fractions ont ensuite été analysées par EZC-LIF afin de vérifier la présence des peptides dans les différentes fractions de collecte.
Anolytes pH Remarques Références
200 mM H3PO4 91 mM H3PO4 10 mM H3PO4 pH < 1 pH 1,7 pH 2.4
La concentration élevée en H3PO4 augmente la
conductivité du milieu, ce qui améliore la reproductibilité des analyses cIEF
pH<< 2.5 : Risque de dégrader le revêtement PVA Anolyte standard
pH<< 2.5 : Risque de dégrader le revêtement PVA L’augmentation du pH de l’anolyte retarde la dégradation d’un capillaire PAA
pH proche de 2.5 : solution compatible avec le
revêtement PVA
116,174
175
98
Catholyte pH Remarques Références
300 mM NaOH
20 mM NaOH
pH >12
pH >12
La concentration élevée en NaOH augmente la
conductivité du milieu ce qui améliore la reproductibilité des analyses cIEF
pH>> 8.6 : pH non compatible avec l’immunodétection Catholyte standard
pH>> 8.6 : pH non compatible avec l’immunodétection
116,174
175
100 mM CAPS pH 9.7 La nature et pH du catholyte retardent la dégradation d’un capillaire PAA
pH> 8.6 : pH non compatible avec l’immunodétection
177
50 mM MES pH 8.4 Le pH très faible du catholyte retarde la dégradation d’un capillaire PAA
pH <8.6 : pH compatible avec l’immunodétection
173
Tableau 9 : Anolytes et catholytes utilisés pour les analyses en cIEF
b. Optimisation de la méthode
i. Les ampholytes
La gamme de pH et le pourcentage total d’ampholytes sont des paramètres critiques pour obtenir une séparation avec un pouvoir de résolution élevé. Nous avons dans un premier temps réalisé la séparation de différents marqueurs de pI (pI 7.2, pI 6.8, pI 6.6 et pI 5.66) dans le capillaire PVA (75 µm). Sur la figure 41, sont reportées les différentes résolutions entre les marqueurs de pI avec la résolution 1 (Rs1) correspondant à la résolution entre les marqueurs de pI 7.2 et 6.8, la résolution 2 (Rs2) à celle entre les marqueurs de pI 6.8 et 6.6 et la résolution 3 (Rs3) à celle entre les marqueurs de pI 6.6 et 5.6. L’analyse utilisant 4% d’ampholytes de gamme de pH large (3-10) permet d’obtenir une très bonne séparation de tous les marqueurs de pI (Rs>2.69) (figure 41a). Cependant, en considérant la perte de résolution éventuelle lorsque les analyses seront réalisées dans un capillaire de 100 µm de diamètre interne, nous avons ajouté des ampholytes de gamme de pH plus étroite au mélange afin d’augmenter davantage la résolution entre les pics. Les figures 41 b-d montrent les séparations obtenues avec différents mélanges d’ampholytes (3-10 et/ou 4.5-6 et/ou 5-8) à différents pourcentages totaux (4, 5 ou 6%). Les combinaisons (b) et (c) n’ont pas permis d’augmenter significativement les résolutions et on observe même une résolution plus faible entre les marqueurs de pI 5.6 et 6.6 (RS3). En revanche, l’augmentation du pourcentage total d’ampholytes à 6% avec un mélange d’ampholyte (5-8) et (3-10) dans un rapport 5/1 a permis d’augmenter considérablement les résolutions entre chaque marqueur de pI (figure 41d). Malgré l’élargissement des pics dans ces conditions, nous avons sélectionné cette dernière composition d’ampholytes pour son pouvoir de résolution élevé. La
99 répétabilité des temps de migration et des aires des marqueurs de pI s’est révélée satisfaisante avec un coefficient de variation (CV) inférieur à 1.3 % et 5% respectivement (n= 5).
Figure 41 : Effet de la gamme de pH (3-10, 4-6 et 5-8) et du pourcentage de pharmalytes
sur la séparation des marqueurs de pI : (a) 4% 3-10, (b) 2% 3-10 et 2% 5-8, (c) 1% 3-10, 1% 4-6 et 3% 5-8, (d) 1% 3-10 et 5% 5-8. Echantillon : 70% gel cIEF, marqueurs de pI (Myogl de pI
7.2 et 6.8, CA I de pI 6.6 et CA de pI 5.6) à 0.08 g/l. Conditions d’analyse : Capillaire PVA, Lt = 31.2 cm, Ld = 21 cm, DI = 75 µm, anolyte H3PO4 (10 mM, pH 2.4), catholyte MES (50 mM, pH 8.3), focalisation : 20 kV/ 8 min excepté pour l’analyse (a) 15 min, mobilisation : 20 kV / 0,3 psi,
température à 25°C, détection UV à 280 nm
ii. Les additifs
Les peptides amyloïdes sont connus pour être des composés très hydrophobes ayant une faible stabilité au cours du temps avec une tendance à s’agréger de manière plus prononcée à pH acide. Aussi, ils doivent être manipulés avec précaution. Chaque jour une solution fraîche de peptides (préparée dans le DMSO et stockée à -32°C) est utilisée. Malgré cette précaution, la focalisation du peptide Aβ 2-40 à son pI a généré l’apparition de « spikes », pics très fins non répétables dus la précipitation du peptide (figure 42a). En effet, la focalisation de peptides hydrophobes aux pH correspondant à leur pI favorise davantage leur précipitation durant les analyses cIEF. Ainsi, nous avons ajouté au mélange de gel cIEF 4 M d’urée afin de réduire les problèmes d’agrégation et de précipitation. Cet agent chaotrope neutre est souvent utilisé pour les analyses cIEF d’anticorps
100 monoclonaux afin de faciliter leur solubilisation 109,116. L’ajout d’urée a permis de diminuer considérablement le nombre de « spikes » (figure 42b). Avec des concentrations supérieures à 4 M d’urée, aucune amélioration significative mais une variation des temps de migration des peptides Aβ a été observée (résultat non montré). Ceci est probablement lié à une solubilisation différente des peptides selon la concentration d’urée utilisée.
Figure 42 : Effet de l’urée sur la solubilisation du peptide Aβ 2-40 et du marqueur de pI 7.2 (Myoglobine ;
0.08 g/l). Echantillon : pharmalytes (3-10) à 1% et 5% 5-8, 70% gel cIEF, marqueur de pI (Myoglobine) à 0.08 g/l et Aβ 2-40 à 46 µM. Mêmes conditions d’analyse que la figure 46 d.
Afin de réduire le temps d’analyse sans augmenter la pression de mobilisation qui risque d’altérer de manière significative la résolution, nous avons ajouté au mélange de gel cIEF l’acide iminodiacétique (IDA) de pI 2.21 qui est généralement utilisé pour limiter la perte d’analytes très acides. Nous avons exploité les propriétés acides de l’IDA qui se focalise à l’extrémité de l’anolyte, jouant ainsi un rôle d’espaceur et décalant de ce fait la zone de focalisation des analytes vers le côté catholyte, les rapprochant ainsi du détecteur. Deux concentrations d’IDA ont été testées (8 et 20 mM). L’ajout d’IDA génère un courant plus élevé que les analyses sans IDA. Nous avons choisi de travailler à 8 mM d’IDA pour un compromis entre analyse rapide et courant pas trop élevé.
L’ensemble des expériences nous a montré que l’analyse des marqueurs de pI utilisant le catholyte MES (50 mM, pH 8.3), l’anolyte H3PO4 (10 mM, pH 2.4), avec des pharmalytes (3-10) à 1% et (5-8) à 5% permet d’obtenir une séparation des marqueurs avec les résolutions les plus élevées. Pour remédier à la forte précipitation du peptide Aβ 2-40, 4 M d’urée ont été ajoutés dans le gel cIEF, ce
101 qui a nettement amélioré la solubilisation et la détection du peptide. Ces conditions ont servi de point de départ pour l’analyse des trois peptides Aβ 1-40, Aβ 2-40 et Aβ 5-40.
c. Adaptation de la méthode CIEF pour la mise en place de la collecte des peptides amyloïdes
Afin de collecter une quantité plus élevée d’échantillon après l’analyse cIEF dans les fractions destinées à l’immuno-détection, nous avons augmenté le diamètre interne du capillaire PVA de 75 à 100 µm. Nous avons du adapter les conditions d’analyse. La tension a été réduite à 15 kV pour éviter l’effet Joule dans le capillaire plus large et la pression de mobilisation a été réduite à 0.1 psi pour maintenir une résolution maximale. Dans ces conditions optimisées, les peptides Aβ 5-40, Aβ 2-40 et Aβ 1-40 ont été détectés en moins de 26 min (figure 43) avec une répétabilité satisfaisante en temps de migration (CV< 1.7%, n=5). Des résolutions élevées de 5.71 entre les peptides Aβ 5-40 et Aβ 2-40 et de 6.86 entre les peptides Aβ 2-2-40 et Aβ 1-2-40 sont observées, ce qui va permettre de réaliser des collectes sans chevauchement.
Figure 43 : Analyse cIEF des peptides Aβ 1-40, Aβ 2-40 et Aβ 5-40.
Echantillon : pharmalytes (3-10) à 1% et 5% 5-8, 70% gel cIEF avec 4 M d’urée, 8 mM d’IDA, Aβ 5-40 et Aβ 2-40 à 4.6 µM et Aβ 1-40 2.3 µM. Conditions d’analyse : Capillaire PVA, Lt = 31.2 cm, Ld = 21 cm, DI = 100 µm, anolyte H3PO4 (10 mM, pH 2.4), catholyte MES (50 mM,
pH 8.3), focalisation : 15 kV/ 6 min, mobilisation : 15 kV / 0,1 psi, température à 25°C, détection UV à 280 nm
d. Fractionnement des peptides amyloïdes
Le développement de la méthode de fractionnement des peptides a consisté dans un premier temps à estimer le temps de parcours des peptides de l’extrémité anodique à l’extrémité cathodique. Afin de mimer l’étape de mobilisation des peptides, un mélange de gel cIEF contenant des ampholytes est
102 introduit par pression (0.1 psi) dans le capillaire préalablement rempli uniquement de gel cIEF. Le signal à 214 nm est enregistré dès le début du remplissage. Les ampholytes absorbant fortement à de faibles longueurs d’onde, une augmentation de la ligne de base est observée à 18,5 min au passage du mélange de gel cIEF-ampholyte devant le détecteur. Le mélange gel cIEF-ampholyte a donc parcouru 21 cm (longueur effective du capillaire) en 18,5 min. Nous pouvons donc en déduire qu’il faut ensuite environ 9 min au gel cIEF-ampholyte pour parcourir les 10.2 cm restant du détecteur à l’extrémité cathodique. Le principe de la collecte est schématisé sur la figure 44 où les fractions de collecte découpant le contenu du capillaire sont corrélées à l’électrophorégramme obtenu pour l’analyse des trois peptides. Nous avons décidé de recueillir les analytes tous les 3 minutes après 16 min d’analyse juste après le passage du peptide 5-40 devant le détecteur. La collecte consiste à changer de vial du côté catholyte tous les 3 minutes de mobilisation. Ceci est répété jusqu’à l’obtention de 8 fractions de collecte. Théoriquement, le peptide Aβ 5-40, avec le pI le plus élevé, est récupéré dans la fraction F3, le peptide Aβ 2-40 dans la fraction F4 et le peptide Aβ 1-40 dans la fraction F6.
Figure 44 : Fractionnement d’un mélange de peptides Aβ 1-40, Aβ 2-40 et Aβ 5-40 lors de l’analyse cIEF.
Collecte de l’échantillon cIEF tous les 3 min. Même conditions d’analyse cIEF que la figure 43. e. Analyse des fractions de collecte de peptides amyloïdes par ECZ-LIF
Afin de vérifier la présence des peptides Aβ 1-40, Aβ 2-40 et Aβ 5-40 dans les fractions respectives F6, F4 et F3, celles-ci sont ensuite analysées par ECZ couplée à une détection fluorescente. Les peptides ont été marqués avec le fluoroprobe FP 488 en adaptant le protocole de dérivation développé au laboratoire 178. Les peptides amyloïdes possèdent trois amines primaires provenant de deux Lysines (pka ~10.54) et de l’amine N-terminale (pka ~8.5), ainsi il existe donc trois sites potentiels de marquage. Cependant, il a été démontré que seules les formes mono-marquées (2 pics) et di-marquées (1 pic) peuvent être détectées. Il faut également noter que les peptides subissent différentes dilutions
103 avant d’être analysés par ECZ-LIF. Au départ, le capillaire PVA est totalement rempli avec l’échantillon, ce qui correspond à un volume de 2.4 µL. Durant la focalisation, la quantité initiale d’un peptide introduite dans le capillaire se focalise en une seule bande fortement concentrée. Durant la mobilisation, chaque bande focalisée est récupérée dans une solution de catholyte de 5 µL pour être collectée. En admettant que la fraction collectée de l’ordre du nanolitre n’augmente pas de manière significative la solution de catholyte (5µL), la collecte des peptides entraine une dilution d’un facteur environ deux de la concentration initiale de chaque peptide. L’étape de marquage des solutions de collecte entraîne également une dilution par deux de la concentration de chaque peptide collecté. Ceci conduit à une dilution par 4 de la concentration initiale de peptide dans la fraction analysée par ECZ-LIF.
Dans un premier temps, nous avons analysé par ECZ-LIF les peptides Aβ 1-40, Aβ 2-40 et Aβ 5-40 dilués directement dans des solutions de collecte obtenues lors du fractionnement d’un échantillon sans peptides, soit des solutions contenant le catholyte, du gel cIEF et des ampholytes (figure 45). Nous nous sommes principalement intéressés aux pics des peptides di-marqués de plus forte intensité que les mono-marqués. Ces analyses ont servi à estimer la mobilité électrophorétique de chaque peptide (-1.8×10-4 cm2/V.s pour le peptide Aβ 2-40 et -1.65×10-4 cm2/V.s pour le peptide Aβ 5-40) qui permettra par la suite de vérifier leur présence lors de l’analyse des fractions de collecte obtenues par cIEF. Le contrôle est réalisé à d’aide de l’analyse d’une solution de collecte sans peptides. Seuls les peptides Aβ 2-40 et Aβ 5-40 di-marqués ont pu être identifiés. Cependant, lorsque le peptide Aβ 1-40 a été dilué dans une solution pure de borate de sodium (40 mM, pH 9.3), et non dans la solution de collecte, ce dernier a bien été détecté (communication personnelle). Nous pouvons en déduire que les conditions de collecte ne permettent pas de détecter le peptide Aβ 1-40 marqué. Ce peptide ne pouvant être détecté, nous avons uniquement vérifié la présence des peptides Aβ 2-40 et Aβ 5-40 dans les fractions de collecte associées.
104
Figure 45 : Identification par ECZ-LIF des peptides Aβ 1-40, Aβ 2-40 et Aβ 5-40 standards dilués dans des
solutions de collecte obtenues lors du fractionnement d’un échantillon cIEF sans peptides.
Concentrations finales en peptides : Aβ 5-40 et Aβ 2-40 à 1.15 µM et Aβ 1-40 à 0.85 µM. Même conditions
d’analyse cIEF que la figure 43. Méthode de marquage et conditions d’analyse ECZ-LIF dans la section « matériels et méthodes »
Tout d’abord, un échantillon contenant uniquement le peptide Aβ 2-40 (4.6 µM) est analysé par cIEF. Huit fractions de collecte de cet échantillon sont récupérées. Une première série de fractions a été obtenue avec le fractionnement d’un échantillon de peptide focalisé. Une deuxième série de fractions a été obtenue avec le fractionnement de trois échantillons de peptide focalisé. Sur la figure 46, sont présentées les analyses des fractions F4 issus des solutions de catholytes enrichies une fois (Cx1 ; 1.15 µM) et trois fois (Cx3 ; 3.45 µM) en échantillon. Dans les deux cas, un pic de même mobilité électrophorétique (-1.8×10-4 cm2/V.s) que le peptide non fractionné préalablement analysé (figure 45) est observé. Ceci permet de confirmer la présence du peptide Aβ 2-40 dans les différentes fractions F4. Cependant, l’analyse du peptide Aβ 2-40 de la fraction F4-Cx1 présente un pic d’intensité plus faible que celle du peptide Aβ 2-40 non fractionné qui est pourtant à la même concentration (1.15 µM). Il a fallu concentrer trois fois les fractions de collecte pour obtenir un signal fluorescent similaire à celui observé lors de l’analyse du peptide Aβ 2-40 non fractionné. Ceci peut s’expliquer par un phénomène d’agrégation du peptide Aβ 2-40 durant l’analyse cIEF conduisant ainsi à la perte importante de signal dans les fractions de peptide fractionné. Malgré le phénomène de précipitation observé, nous avons mis en évidence la fiabilité de la méthode de collecte du peptide Aβ 2-40.
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Figure 46 : Identification par ECZ-LIF du peptide Aβ 2-40 issu des fractions de collecte concentrées une
fois (Cx1) ou trois fois (Cx3) en peptide Aβ 2-40 focalisé (fraction F4)
Concentrations finales en peptides : Aβ 2-40 à 1.15 µM (Cx1) ou 3.45 µM (Cx3). Même conditions d’analyse cIEF que la figure 43. Collecte selon le fractionnement de la figure 44. Méthode de marquage et conditions
d’analyse ECZ-LIF dans la section « matériels et méthodes »
Un autre test pour confirmer la présence du peptide Aβ 5-40 dans la fraction F3 a été réalisé. Pour compenser la perte de sensibilité liée à l’agrégation des peptides, les fractions ont été obtenue avec le fractionnement de trois échantillons de peptide Aβ 5-40 focalisé. Sur la figure 47, sont présentées l’analyse de la fraction F3 issus des collectes enrichies trois fois en Aβ 5-40 focalisé (Cx3 ; 3.45 µM) et celle du peptide non fractionné (1.15 µM). La mobilité électrophorétique de chaque pic permet de confirmer la présence du peptide Aβ 5-40 dans la fraction F3.
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Figure 47 : Identification par ECZ-LIF du peptide Aβ 5-40 issus des fractions F3 concentrés trois fois en
peptide focalisé comparé à l’analyse du peptide non focalisé
Concentrations finales en peptides : Aβ 5-40 à 3.45 µM (Cx3) ou 1.15 µM. Même conditions d’analyse cIEF
que la figure 43. Collecte selon le fractionnement de la figure 44. Méthode de marquage et conditions d’analyse ECZ-LIF dans la section « matériels et méthodes »
Cependant, malgré la concentration de la fraction F3 (3.45 µM), l’intensité reste très faible comparé au signal obtenu avec le peptide non focalisé (1.15 µM). Pour expliquer cette faible intensité, l’hypothèse suivante a été proposée ; le peptide Aβ 5-40 a été très probablement collecté dans deux vials de collecte différents (fractions F2 et F3), ce qui expliquerait la difficulté de détection. Finalement, en superposant les fractions F2, F3, F4 et F5 (figure 48) issus d’un mélange de peptides Aβ 2-40 et Aβ 5-40, nous avons constaté que le peptide Aβ 2-40 a bien été détecté uniquement dans la fraction F4 tandis que le peptide Aβ 5-40 a été identifié dans les collectes F2 et F3.
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Figure 48 : Identification par ECZ-LIF des peptides Aβ 2-40 et Aβ 5-40 (A) lors de l’analyse des fractions
F3 ou (B) des fractions F2, F3, F4 et F5.
Concentrations finales en peptides (Cx3): Aβ 5-40 à 3.45 µM et Aβ 2-40 à 3.45 µM. Même conditions d’analyse cIEF
que la figure 43. Collecte selon le fractionnement de la figure 44. Méthode de marquage et conditions d’analyse ECZ-LIF dans la section « matériels et méthodes »
En conclusion, nous avons développé une méthode de séparation par cIEF avec un pouvoir de résolution élevée (Rs> 5.71) pour les trois peptides Aβ 5-40, Aβ 2-40 et Aβ 1-40. La présence des peptides Aβ 5-40 et Aβ 2-40 dans des fractions de collecte différentes pendant l’analyse cIEF a été confirmé par l’analyse ECZ-LIF de ces fractions de collecte. Bien que le peptide Aβ 5-40 soit retrouvé dans deux fractions F2 et F3, les deux peptides Aβ 5-40 et Aβ 2-40 peuvent être séparés et isolés dans des solutions indépendantes. La résolution entre les peptides Aβ 2-40 et Aβ 1-40 (Rs=6.86) étant plus élevé que celle entre les peptides Aβ 5-40 et Aβ 2-40 (Rs=5.71), nous pouvons penser aisément que le peptide Aβ 1-40 peut être isolé dans une solution indépendante des deux autres peptides Aβ. Ainsi les résultats sont prometteurs pour l’étude sur l’immunodétection des fractions de collecte qui est présentée dans le chapitre 5 suivant.
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