d'immunodosage en gouttes
Annexe 4 Mesure de la mobilité électroosmotique basée sur l’analyse frontale
La méthode frontale est basée sur l’injection électrocinétique frontale d’un échantillon. Dans notre cas, elle consiste à faire migrer un échantillon fluorescent d’une extrémité à l’autre du canal en verre. Lors du passage de l’échantillon devant le détecteur, un front fluorescent est ainsi détecté. Le principe de la méthode frontale est décrit dans la figure 62. Le canal est rempli d’un tampon donné (Figure 62A-1), l’un des réservoirs est remplacé par l’échantillon (Figure 62A-2) et sous l’action d’un champ électrique la molécule fluorescente migre jusqu’au détecteur (Figure 62A-3). Un front fluorescent est détecté au niveau du détecteur puis le signal est traité par sa dérivée première qui permet d’obtenir un pic dont le maximum correspond au temps de migration de la molécule fluorescente (Figure 62B).
Figure 62 : (A) Principe de l’analyse frontale avec (1) le remplissage du canal avec le tampon d’analyse, (2)
le remplacement d’un réservoir de tampon par l’échantillon fluorescent et (3) la migration de l’échantillon vers le réservoir opposé à l’application d’un champ électrique (B) Electrophorégrammes obtenus
Aussi, pour estimer la µeo d’une surface générant un FEO élevée, l’utilisation d’un marqueur neutre suffit à calculer la µeo à partir du temps de migration obtenue. Cependant, dans le cas d’une surface générant un FEO faible (puce traitée), une méthode frontale indirecte est utilisée afin d’estimer plus rapidement la µeo. Pour ce faire, dans un premier temps, une molécule fluorescente chargée et une molécule fluorescente neutre sont injectées dans une puce en verre vierge qui génère un FEO élevé.
172 Les mobilités apparentes de la molécule chargée (µapp) et de la molécule neutre (correspondant à la µeo) sont calculées. Ceci permet de déduire la mobilité électrophorétique de la molécule chargée dans un tampon donné selon l’équation 18 :
µep=µapp-µeo
(18)Pour évaluer le FEO généré dans la puce en verre traitée, il suffit ensuite d’injecter uniquement la molécule chargée et de mesurer sa µapp. Sa µep ayant déjà été calculée au préalable, ceci permet de déduire la µeo de la surface traitée.
Dans notre étude, la molécule chargée utilisée est le fluorophore NHS 488 (négativement chargée à pH alcalin) et la molécule neutre est la coumarine 334. Les analyses ont été réalisées dans un canal en verre de DI 150 µm x 150 µm et de longueur totale de 10.6 cm. Le tampon utilisé est un tampon borate (FI=20 mM, pH 9). La µeo mesurée est de 5.06 0.25 x 10 -4 cm2. V-1. s-1 et la µep du fluorophore NHS 488 est de 2.12 0.17x 10 -4 cm2. V-1. s-1.
Annexe 5 : Conditions d’analyse de l’analyse IEF
Les conditions expérimentales utilisées lors de l’analyse du marqueur de pI 6.2 sont les suivantes : Canal en THV Dyneon de DI de 150µm x 100 µm et de longueur totale de 2.5 cm, anolyte H3PO4 (50 mM), catholyte NaOH (50 mM), focalisation : 150 sec à 600V, détection fluorescente (filtres : λex 455-590 nm and λem505-555 nm).
Le marqueur de pI 6.2 fluorescent à faible poids moléculaire est fourni par Sigma Aldrish en solution de concentration mère 1 mg/mL dans une solution de 10 mM en HCl (Sigma Aldrish).
173
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179
180 Titre : Développement d'une plateforme analytique couplant la séparation de bio-marqueurs à une
immuno-détection digitale en gouttes pour le diagnostic de la maladie d'Alzheimer
Mots clés : microsystème, séparations électrocinétiques, bio-marqueurs, gouttes, maladie d’Alzheimer, Elisa Résumé : L’émergence de nouvelles technologies
basées sur la microfluidique de gouttes offre l’espoir de développer des immuno-essais complexes consommant peu d’échantillon. Cette thèse est dédiée d’une part au développement d’une plateforme d’analyse qui consiste au fractionnement d’un mélange de peptides amyloïdes par focalisation isoélectrique (IEF) pour ensuite procéder à l’immuno-détection en gouttes des différentes fractions. Une méthode d’IEF en capillaire a été développée et a permis la séparation des peptides Aβ 1-40, Aβ 2-40 et Aβ 5-40 ainsi que leur collecte dans des solutions individuelles. Ces solutions de collectes ont été analysées par Elisa sur particules magnétiques. L’immuno-essais a permis de déterminer la distribution des peptides dans les différentes collectes. Ces analyses ont d’abord été réalisées en « batch » où les particules magnétiques sont en suspension dans une solution non-confinée. Ensuite, un dispositif permettant de réaliser des immuno-essais en gouttes a été utilisé. Cette plateforme a été adaptée et optimisée pour le dosage des peptides Aβ 1-40 et Aβ 1-42 standard en vue de doser ces peptides dans le LCR et d’étendre
l’analyse aux autres peptides (Aβ 2-40 et Aβ 5-40). D’autre part, une partie de la thèse a été dédiée à un travail sur micro-puce en vue de la conception d’un microsystème d’analyse totale intégrant en ligne les trois étapes (séparation, compartimentalisation, immuno-détection en gouttes) de la plateforme d’analyse recherchée. Pour cette partie nous avons choisi le THV Dyneon qui a déjà servi au transport de bio-molécules en gouttes. Une première étude a consisté pour la première fois à réaliser des séparations électrocinétiques de protéines et de fluorophores hydrophobes dans les puces en THV Dyneon en utilisant deux modes de séparation (ECZ et NACE, respectivement). Ceci a permis de démontrer que ce nouveau matériau constitue un candidat prometteur pour le futur microsystème couplant séparation et compartimentalisation en gouttes. Une dernière étude a consisté au développement d’une méthode de marquage des peptides amyloïdes par un nouvel agent fluorescent, le Chromeo P540, particulièrement adapté pour des analyses IEF. Cet agent de marquage permettra de détecter les peptides durant la conception de l’interface de couplage (IEF/gouttes).
Title : Developpment of an analytical platform combining a separation of biomarkers with a immunoassay detection in droplets for Alzheimer disease diagnosis
Keywords : microdevice, electrokinetic separation, biomarkers, droplets ; alzheimer disease, Elisa Abstract : Emerging droplet-based microfluidic
platform provide new opportunities to develop complex immunoassay with low sample consumption. This manuscript is dedicated on the development of an analytical platform for isoelectric focusing of amyloid peptides followed by their detection by immunoassay droplet-based microfluidic platform. A capillary isoeletric focusing method was developed first and allowed separation and collection of Aβ 1-40, Aβ 2-40 and Aβ 5-40 peptides in individual solutions. The fractions collected were analyzed off-line by Elisa on magnetic beads in batch-wise. This immune-detection allows the determination of peptide distribution in the different fractions collected. Then, we used a droplet-based microfluidic platform for immunoassay on magnetic beads. This platform was adapted and optimized to quantify standard Aβ 1-40 and Aβ 1-42 peptides. The next step will rely on the quantification of amyloid peptides on cerebrospinal fluid. In parallel, a study
dedicated on microchip analyses to design a total-analysis-system has been performed. The final purpose is to integrate on-line three main steps; separation, compartmentalization and immune-detection in droplet. For this study, THV Dyneon has been chosen since this material was also used for the droplet-based microfluidic platform. A first study demonstrated for the first time electrokinetic separation, of biomolecules (proteins) and hydrophobic dyes in Dyneon THV chip using two separations modes (CZE and NACE respectively). This work highlighted the THV Dyneon micro-chip versatility. We can concluded that this new material is promising for further development dedicated to micro system combining separation and compartmentalization in droplet. A last work aimed to develop a labeling method for amyloid peptides with a new dye, the Chromeo P540, which is adapted for isoeletric focusing (IEF) analysis. This dye will allow peptides monitoring during the development of IEF/droplet interface.