a. La microfluidique de gouttes
La microfluidique de gouttes est divisée en deux catégories : (i) l’une basée sur le déplacement par mouillabilité électro-induit d’une goutte d’eau sur une surface hydrophobe et (ii) l’autre basée sur le déplacement de gouttes en suspension, résultant d’une émulsion entre deux fluides non miscibles, qui sont soumis au déplacement d’un fluide porteur 160. Nous nous sommes intéressés à la deuxième catégorie, la plus employée et la plus simple à mettre en œuvre. L’avantage de cette dernière approche réside dans la suspension complète des gouttes dans un fluide porteur. Ceci évite que les gouttes interagissent avec les surfaces environnantes et donc la contamination de ces surfaces. Par ailleurs, les fluides porteurs (qui transportent les gouttes aqueuses) les plus utilisés sont les huiles fluorocarbonées et hydrocarbonées. Les huiles perfluorées sont particulièrement intéressantes pour leur immiscibilité avec des solvants organiques et aqueux ainsi que leur stabilité physique et chimique. Cependant, les gouttes nécessitent d’être stabilisées afin de résister aux phénomènes physiques pouvant les diviser ou les faire fusionner entre elles durant leur transport. C’est pourquoi l’utilisation de surfactant est essentielle et généralement les émulsions de gouttes dans les huiles fluorées sont stabilisées par des surfactants également fluorés.
82 Pour décrire la formation des gouttes dans un système microfluidique, les paramètres suivants peuvent être utilisés 161:
Le nombre de Reynolds (Re) qui décrit l’importance relative des forces d’inertie par rapport aux forces de viscosité ;
Le nombre de Weber (We) qui compare les effets d’inertie aux tensions de surface ;
Le nombre de Bond (Bo) qui détermine la relation entre les forces de surface gravitationnelles et celles de tension de surface ;
Le nombre de Capillaire (Ca) qui représente les effets des forces visqueuses sur les forces de tension inter-faciale liquide/liquide (forces capillaires).
Les effets d’inertie sont interprétés comme des transferts convectifs alors que les effets de viscosités sont interprétés comme un transfert diffusif. Dans les systèmes microfluidiques, les écoulements sont de faibles nombres de Re, ce qui signifie que les forces de viscosité prédominent. De plus, les forces gravitationnelles peuvent être négligées par rapport aux forces de viscosité. Ainsi, les effets de tensions de surface et de viscosité prédominent dans le système, ce qui signifie que les valeurs des nombres We et Ca sont les plus influents et en particulier le nombre Ca qui est défini par l’équation (16) suivante :
Ca =
.Vγ (16)
Avec : la viscosité du fluide, V : la vélocité et γ : la tension de surface (eau/huile)
Si les valeurs de Ca sont faibles (<1), les tensions de surface dominent et les gouttes sont sphériques dans le cas d’un système non confiné. Dans le cas où les gouttes sont dans un système confiné, leur forme dépendra de la géométrie du canal. Mais lorsque la valeur de Ca est élevée (>>1), les forces de viscosités dominent, ce qui conduit à la déformation des gouttes par le flux qui est caractérisée par des formes asymétriques. En revanche, la géométrie des canaux générant les gouttes joue également un rôle clé sur leur formation. Plusieurs configurations vont être présentées dans le paragraphe suivant.
La méthode la plus commune pour générer des gouttes est celle qui utilise les phénomènes hydrodynamiques. Trois configurations où tous les fluides sont en flux continus sont principalement utilisées pour la génération de gouttes par la méthode hydrodynamique (figure 35). La jonction T est la configuration la plus commune. Les canaux sont typiquement orthogonaux et les gouttes sont formées à l’intersection des canaux (figure 35A). Alors que la jonction T compresse la phase dispersée sur une direction, la focalisation de flux utilise deux courants de fluides continus provenant
83 de deux directions opposées pour presser le fluide à la sortie du capillaire (figure 35 C). La formation des gouttes utilisant la géométrie co-axiale consiste, quant à elle, à intégrer un micro-canal dans un capillaire. Le fluide autour de la sortie du capillaire va comprimer la phase dispersée qui sort du capillaire pour générer des gouttes (figure 35 B).
Figure 35 : Schéma de systèmes microfluidiques pour générer des goutes en utilisant (A) la jonction en T,
(B) la géométrie co-axiale et (C) la focalisation de flux 161
A l’heure actuelle, des microsystèmes de plus en plus complexes ne cessent d’être développés. Les récentes avancées en microfluidique de gouttes pour l’analyse de biomolécules sont très bien résumées dans plusieurs revues 160–162. Toutefois, il est important de noter que celles-ci ont permis le développement de plateformes basées sur la microfluidique de gouttes très performantes pour des applications biomédicales. La PCR en gouttes (ou en émulsion) a tout particulièrement suscité une attention particulière dans le domaine de la cancérologie 163,164.
b. Couplage : séparation et compartimentalisation en gouttes
Le couplage de la séparation à la compartimentalisation en gouttes permettant l’isolement de bandes séparées tout en maintenant une résolution élevée n’est pas triviale. Néanmoins, quelques travaux ont montré qu’il était possible de coupler des méthodes de séparation EC ou de chromatographie
84 liquide à la compartimentalisation en gouttes 165. Afin de démontrer l’intérêt de ce couplage, quelques exemples sont présentés ici.
Edgar et al. ont développé un système couplant en ligne la séparation électrophorétique à la compartimentalisation des bandes séparées par électrophorèse capillaire (figure 36 A). La génération de gouttes microfluidiques a été possible grâce à l’émulsion diphasique entre l’échantillon aqueux sortant du capillaire et la phase non miscible à base d’huile située à l’extrémité du capillaire. L’introduction de l’échantillon à l’interface de croisement avec la phase non miscible (coulant en flux continu), est assurée par le FEO généré lorsqu’une tension élevée est appliquée. L’échantillon composé de trois molécules fluorescentes (FITC-phenylanaline, FITC-glycine et FITC-glutamate) a été suivit à l’aide de plusieurs détecteurs disposés en amont de l’interface de couplage et après l’encapsulation en gouttes. Le confinement du FITC-glutamate en une série de gouttes a été mis en évidence (figure 36 B). Ainsi, ce concept offre une approche limitant la diffusion moléculaire durant le processus de compartimentalisation en confinant chaque molécule séparée en une série de gouttes.
Figure 36 : Compartimentalisation de composés séparés par EC. (a) Schéma du principe d’encapsulation des
bandes séparées. (b) Electrophorégramme obtenu après la génération de gouttes. Phe : FITC-phenylanaline ; Gly : FITC-glycine ; Glu : FITC-glutamate 166
Niu et al. ont développé un système couplant deux modes de séparation à la compartimentalisation 167. Ce dispositif consiste à la séparation d’un mélange de peptides par chromatographie liquide dans
85 un premier temps. Les bandes séparées sont ensuite encapsulées dans des gouttes (figure 37a) puis transportées vers une interface qui libère la composition de chaque goutte dans un capillaire (figure 37b). Le contenu de chaque goutte va ensuite être analysé par électrophorèse capillaire. Ce dispositif permet ainsi la séparation en 2D en ligne de deux modes de séparation très différents à l’aide d’un système de compartimentalisation en gouttes et de libération des gouttes.
Figure 37 : (A) Première dimension de la séparation par chromatographie à phase liquide (HPLC) et
encapsulation. (B) Délivrance des bandes encapsulées dans le capillaire pour une deuxième séparation par EC 167
Une approche différente a été développée par Zhao 168. Elle consiste à fractionner un échantillon par IEF sur puce puis à le compartimentaliser en plusieurs puits à l’aide d’un système ingénieux modifiant la conformation de la puce. Ce système est basé sur la mobilisation du canal de séparation en zigzag à deux étages et 4 puits parallèles superposés (figure 38). Après l’étape d’IEF, un système de glissement des deux parties de la puce va générer 8 compartiments isolés qui contient les bandes séparées. Ainsi, ce dispositif propose une méthode de préparation d’échantillon simple pour collecter individuellement les bandes séparées dans un volume isolé en vue de les analyser par d’autres méthodes analytiques telles que la SM.
86
Figure 38 : Schéma du système « slipchip ». (A) Chargement de l’échantillon dans le canal en zigzag. (B)
Focalisation isoélectrique des marqueurs de pI. (C) Compartimentalisation des bandes séparées après le glissement opposé des deux plaques en PMMA. 168
Pour conclure ce chapitre, nous avons mis en évidence le potentiel des systèmes miniaturisés pour des analyses rapides et peu coûteuses (diminution de la consommation d’échantillon). L’utilisation de matériaux polymériques permet également de réduire les coûts de fabrication des microsystèmes mais leur utilisation représente un défi majeur, notamment à cause des problèmes d’adsorption des biomolécules à la surface des canaux. Par ailleurs, le développement de plateformes microfluidiques très performantes pour le diagnostic de cancers a récemment démontré le fort potentiel de la détection en gouttes. Le couplage original des méthodes séparatives avec la microfluidique de gouttes dans le but de compartimentaliser des bandes séparées est également très intéressant car il permet la détection d’une molécule isolée issue d’un mélange complexe.
87
PARTIE EXPERIMENTALE
89
Introduction du projet
Dans le cadre de cette thèse, nous avons participé à un projet ANR intitulé « Digital Diagnostic » (DigiDiag), d’une durée de 5 ans (juin 2012-2017). Ce projet a été créé dans l’objectif de développer des laboratoires sur puce pour des applications en diagnostic, en médecine personnalisée et en management clinique. Le programme scientifique du projet DigiDiag est divisé en 18 workpackages de trois types :
- Workpackages techniques : recherche et développement de plateforme microfluidique dont la technologie principale est le développement de dispositif sur gouttes
- Workpackages d’application : développement d’outil de diagnostic digital pour une maladie. L’un des champs d’application majeur est le diagnostic et le management clinique des cancers colorectaux, du poumon, du sein ou encore de maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer
- Workpackages cliniques : essais cliniques pour la validation des procédures microfluidiques développées comme celle de l’amplification digitale de l’ADN
Un consortium multidisciplinaire regroupant des partenaires avec des expertises complémentaires a été constitué afin de réaliser ces 18 workpackages. Les différents partenaires partagent leurs compétences en micro/nanofabrication, micro/nanofluidique, chimie, physico-chimie, biochimie, biologie moléculaire, biologie cellulaire, instrumentation et médecine clinique. Mon travail au sein de ce projet fait partie du workpackage 10 intitulé « Digital analysis of protein biomarkers towards multimodal Alzheimer's disease diagnosis ». Trois partenaires participent à ce workpackage dont l’équipe de « Macromolecules and Microsystems in Biology and Medicine » (MMBM) dirigée par Jean-Louis Viovy de l’Institut Curie de Paris, l’équipe « Molecular Engineering of Proteins » (MEP) dirigée par Philippe Bergonzo du CEA de Saclay et notre équipe. Le workpackage vise ainsi aux développements d’outils analytiques innovants et peu coûteux pour l’analyse multiplexée de biomarqueurs pour le diagnostic de la MA.
Les plateformes d’analyse basées sur la microfluidique de gouttes, en plein essor, offrent cette possibilité. Ces systèmes reposent sur la compartimentalisation de faible volume d’échantillon dans des gouttes microfluidiques pour l’analyse individuelle d’une molécule cible, chaque goutte agissant comme un microréacteur indépendant. Leurs applications s’étendent de l’analyse de cellules ou d’une
90 molécule unique 169, à l’amplification de l’ADN 163,164 en passant par l’étude de réactions enzymatiques 162,170. Ainsi, l’utilisation de la microfluidique de gouttes pour des systèmes analytiques apportent de nombreux avantages tels que : la capacité de réaliser des réactions à l’échelle du micro- voir du femto-litre ; la génération de débit élevé et la manipulation de microréacteur ; l’élimination de la diffusion Taylor et de la dilution de l’échantillon ; la réduction de l’adsorption des échantillons sur la surface des canaux ; un meilleur mixage et transfert de masse dans les gouttes 170. Par ailleurs,
l’étude bibliographique sur la MA, ses biomarqueurs et son diagnostic (chapitres 1 et 2) a montré que l’analyse multiplexée de biomarqueurs est l’approche qui permet de se conformer au mieux aux exigences requises pour le diagnostic de la MA en termes de fiabilité, spécificité et sensibilité.
Dans ce contexte, l’objectif du projet est de développer un dispositif peu coûteux couplant la séparation par IEF d’un mélange de biomarqueurs de la MA à leur immunodétection en gouttes. Notre étude cible en particulier le dosage des peptides amyloïdes. Ce dispositif sera à terme appliqué aux fluides biologiques pour le diagnostic de la MA. Cette thèse s’appuie en partie sur le travail de thèse de Anais Ali-Cherif qui a développé un dispositif en gouttes pour le dosage par Elisa de l’hormone thyroïdienne 171. La manipulation de particules magnétiques (sur lesquelles sont greffés les anticorps de capture) dans les gouttes microfluidiques a permis de contrôler un train de gouttes transportant tous les réactifs et solutions de rinçage nécessaire à la réalisation de l’Elisa en gouttes.
Deux stratégies pour développer le dispositif recherché sont décrites dans la partie expérimentale. La première stratégie a consisté à coupler en off-line (en mode indirect) la séparation des peptides par focalisation isoélectrique en capillaire (cIEF) à la plateforme d’immunodosage en gouttes. Le chapitres 4 décrit le développement d’une méthode cIEF pour la séparation des peptides amyloïdes tronqués à l’extrémité N-terminal (Aβ 1-40, Aβ 2-40 et Aβ 5-40). Le chapitre 5 est dédié à la mise au point de l’immunodosage des peptides amyloïdes sur la plateforme d’imuunoessais. Ce travail est réalisé dans le but de coupler la collecte des peptides séparés par cIEF avec l’immunodétection en gouttes. Les chapitres 4 et 5 sont ainsi consacrés à la première stratégie de la thèse. Le chapitre 6 est consacré à la deuxième stratégie de la thèse qui consiste à développer un microsystème couplant en ligne la séparation par IEF des biomarqueurs de la MA, la compartimentalisation en gouttes des bandes séparées et l’immunodétection en gouttes. Ce travail est divisé en deux parties. Une partie est consacrée à l’étude d’un nouveau matériau, le THV Dyneon, présentant des propriétés intéressantes pour la microfluidique de gouttes, ce qui facilitera le couplage du module de séparation avec le module de compartimentalisation. Ce matériau n’ayant jamais été utilisé pour des séparations électrocinétiques sur puce, nous avons focalisé l’étude sur la réalisation de séparations électrocinétiques pour l’analyse de protéines et de molécules hydrophobes. La deuxième partie du
91 chapitre concerne la mise au point d’une méthode IEF pour la séparation de peptides amyloïdes marqués par un agent fluorescent qui permettra de détecter facilement les peptides amyloïdes durant le développement du futur microsystème.
92
Chapitre 4 : Fractionnement d’un mélange de peptides amyloïdes par
focalisation isoélectrique capillaire
1. Introduction
La première stratégie envisagée dans le cadre de cette thèse était le couplage off-line d’une étape de séparation avec une étape d’immunodétection à l’aide d’une plateforme basé sur la microfluidique de gouttes. Ce couplage consiste à fractionner un mélange de peptides selon leur pI et à collecter les peptides focalisés dans différentes fractions qui seront par la suite analysées par Elisa en gouttes. Dans ce chapitre, est présentée la méthode cIEF que nous avons développée et optimisée afin d’isoler chaque peptide Aβ à partir d’un mélange alors que l’étude sur l’immunodétection en gouttes des fractions de collecte sera présentée dans le chapitre 5.
L’intérêt de préparer l’échantillon par cIEF avant l’immunodétection s’explique par un manque d’anticorps commercialement disponibles pour certaines formes de peptides Aβ. Bien qu’il existe un panel d’anticorps spécifiquement dirigés contre l’extrémité C-terminale des peptides Aβ X-42 (Ac 12F4), Aβ X-40 (Ac G210), Aβ X-38 (Ac biotin anti-Aβ 1-38) et Aβ X-43 (9C4) (figure 39), ils ne permettent pas de différencier les peptides Aβ ayant une extrémité N-terminale différente (par exemple, Aβ 1-40, Aβ 2-40 et Aβ 5-40). La séparation préalable par cIEF de ces peptides « N-tronqués » (ayant des pIs différents) est donc nécessaire pour identifier et doser par la suite l’ensemble des formes non tronquées et tronquées. Dans notre projet, la plateforme recherchée ouvre des perspectives de multiplexage très intéressantes grâce à la possibilité d’utiliser des anticorps de capture différents pour chaque fraction confinée dans une goutte comparé à d’autres systèmes tel que le système Nanopro qui ne permet pas d’isoler les fractions séparées 75.
Figure 39 : Séquence de quatre peptides amyloïdes et les anticorps associés. Les anticorps 9C4, 12F4, G2-10
et anti-1-38 sont spécifiquement dirigés contre l’extrémité C-terminale alors que les anticorps 6E10 et 4G8 reconnaissent des séquences d’acides aminés communes aux quatre peptides amyloïdes
93 Les peptides Aβ40 étant moins hydrophobes que les peptides Aβ42, nous avons choisi de développer la méthode cIEF avec les peptides Aβ40 pour une preuve de concept. Nous nous sommes essentiellement intéressés aux peptides Aβ 1-40, Aβ 2-40 et Aβ 5-40. Ces peptides ont des structures très proches et présentent des pIs qui diffèrent de 0,5 unité de pH :
Aβ 5-40 de pI 6.77 ou 6.27 selon le mode de calcul utilisé Aβ 2-40 de pI 6.25 ou 5.78
Aβ 1-40 de pI 5.59 ou 5.31
Les valeurs de pI indiquées sont des valeurs théoriques calculées via deux outils différents : ProteinCalculator v3.3 (www.scripps.edu/∼cdputnam/protcalc.html) ou ProtParam (web.expasy.org/protparam/).
Compte tenu des valeurs de pI très proches des peptides amyloïdes, le développement d’une méthode de séparation par cIEF qui a un pouvoir de résolution élevé est donc nécessaire. Plusieurs critères sont requis pour pouvoir coupler cette méthode avec l’immunodétection en gouttes :
Une séparation hautement résolutive pour la collecte de chaque peptide isolé dans une fraction bien distincte
Une bonne répétabilité des temps de migration
Un milieu de collecte non dénaturant pour les anticorps de capture lors de l’étape d’immunodétection.
L’utilisation de l’électrophorèse capillaire comme technique micropréparatrice a déjà été décrite pour le couplage indirect (off-line) avec différents systèmes de détection tels que la spectrométrie de masse en mode MALDI (matrix assisted laser desorption/ionization) 172,173. Pour le fractionnement d’échantillon par cIEF, les dispositifs utilisés nécessitaient la mise en place d’une interface couplant l’extrémité cathodique du capillaire à un liquide en flux continu soumis à une tension électrique afin de maintenir la tension durant l’étape de mobilisation (figure 40). Généralement, ce liquide correspondait à la solution de catholyte si les analytes étaient mobilisés par pression hydrodynamique. Bien que l’efficacité de ce dispositif ait été démontrée, nous avons opté pour la collecte des fractions en utilisant un appareil d’électrophorèse capillaire classique pour une mise en œuvre plus simple qui ne demande pas de matériel spécifique. Notre méthode consiste à collecter les peptides préalablement séparés dans différentes solutions de catholyte en appliquant la tension électrique de manière séquentielle à chaque changement de solution. L’objectif consistant à collecter les fractions de peptides Aβ pour procéder à leur immunodétection en aval, le mode de détection UV pour la méthode
94 de collecte a été privilégié afin de conserver les peptides dans leur état natif. Ce travail a donc consisté dans un premier temps à optimiser les paramètres de séparation (pourcentage, gamme de pH d’ampholyte) pour atteindre une résolution optimale à l’aide de marqueurs de pI proche des peptides d’intérêt. Les conditions d’analyse permettant de limiter la précipitation des peptides ont été également étudiées. Enfin, les fractions de collecte ont été analysées par ECZ-LIF afin de vérifier la présence des peptides.
Figure 40: Interface qui maintient un flux liquide continu sous tension durant la collecte des analytes 173
2. Matériels et méthodes a. Matériels et réactifs
Matériels : Une électrophorèse capillaire (PA800 ; AB Sciex) équipée d’un détecteur UV a été utilisée pour toutes les analyses. Des capillaires vierges (Phymep, Paris, France) et des capillaires PVA de diamètre interne de 75 µm ou 100 µm, de longueur totale (Lt) 31,2 cm et de longueur effective (Leff) 21 cm (Agilent, Les Ulis, France) ont été utilisés.
Réactifs : Le gel cIEF et la solution de rinçage à base de formamide sont fournis par la société AB Sciex. L’urée, le dimethyl sulfoxide (DMSO), le Diaminobutane chloride (DAB), l’ammonium hydroxide (NH4OH, 28%), la bicine, le 3-(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio)-1-propanesulfonate (CHAPS), l’acide borique, l’acide iminodiacétique (IDA), le 2-[N-morpholino]ethanesulfonic acid (MES), les ampholytes (pharmalytes) de différentes gammes de pH (3-10, 4-6 et 5-8), les protéines (Myoglobines, Anhydrase carbonique I, Anhydrase carbonique) et la solution de soude à 1M ont été acheté chez la société Sigma-Aldrich. Le fluoroprobe FP 488 est fourni par la société Interchim. Les peptides amyloïdes (Aβ 1-40, Aβ 2-40 et Aβ 5-40) sont fournis par la société Eurogentec.
95 b. Méthodes
Préparation des solutions
Préparation des solutions de peptides amyloïdes et protéines : Les peptides amyloïdes sont dissous dans une solution de DMSO pur à 2 mg/mL. L’échantillon est divisé en plusieurs aliquots de 10 µL et conservés à -32°C. Avant analyse, chaque aliquot de peptides amyloïdes est dilué dans une solution composée de 20 mM de bicine et 0,6% de CHAPS (pH 7,6) avant d’être mélangé à la solution d’ampholyte et de gel dédiée à la cIEF. Les protéines (Myoglobines, pI 7.2 et 6.8 ; Anhydrase carbonique I, pI 6.6 ; Anhydrase carbonique, pI 5.66) utilisées comme marqueurs de pI, sont dissoutes dans l’eau à 4 mg/mL et stockés à -32 °C.
Préparation des solutions tampons et des solutions d’anolyte et de catholyte : Le tampon bicine-CHAPS est préparé avec 32.6 mg de bicine et 61.4 mg de bicine-CHAPS dissous dans 10 mL d’eau pour