Résultat préliminaire

Des échantillons d’ADN simple brin (R.rup, 139 bases) ont été analysés par la méthode Hybridation-SERRS mise au point dans le chapitre 2, en comparant une sonde de détection classique, i.e. un oligonucléotide marqué par une molécule de R6G, des nanoparticules d’or fonctionnalisées selon le protocole de Storhoff notées AuNP ainsi que des particules fonctionnalisées selon le protocole de Storhoff modifié notées AuNP-TCEP (Figure A1–3 a).

Figure A1 – 3 : Amplification du signal SERRS final par utilisation de nanoparticules

d’or greffées. a) sans dépôt d’argent; b) avec dépôt d’argent.

Lorsque l’on remplace la simple sonde de détection par les AuNP, on observe une réduction

de l’intensité du signal : l’aire A1650, aire du pic le plus intense caractéristique de la R6G,

diminue de presque 50% (Figure A1 – 3 a). La fixation des sondes thiolées en surface des

particules d’or est inefficace. Lorsque le protocole d’hybridation-SERRS se fait avec les

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standard (Figure A1 - 3 a). La fixation des sondes est donc fortement facilitée par l’introduction d’une étape d’incubation avec du TCEP, plus de 10 fois plus de sondes ont pu être fixées sur les particules d’or. D’autre part, les nanoparticules d’or peuvent concurrencer les surfaces d’argent pour l’adsorption des molécules de R6G. On peut imaginer un repliement des sondes sur elles-mêmes, amenant la molécule de R6G plus proche de la surface d’or que de la surface des particules d’argent. Or, le colloïde d’or n’entraine pas de signal SERRS de la part de la molécule de R6G à la longueur d’onde d’excitation 514.5 nm (données non présentées). Nous avons donc mimé le principe du dépôt d’argent, ou « silver enhancement ». Plusieurs études récentes utilisent le dépôt d’argent comme moyen de révélation des particules d’or en détection scanométrique (Nam, Stoeva et al. 2004; Thaxton, Hill et al. 2005; Hill, Mirkin et al. 2007). Ces particules sont. Une couche d’argent est déposée sur les particules d’or, trop petites pour être détectées sans cette étape.

Nous allons donc tirer parti de cette technique, et précipiter de l’argent en surface des particules d’or. Ainsi, non seulement la surface des particules d’or ne sera plus disponible pour une adsorption compétitive, mais elle sera de plus recouverte d’une couche de citrate d’argent similaire au colloïde utilisé pour les mesures SERRS. Avant l’étape de lavage des micro-billes magnétiques, nous avons donc prélevé 20 ml de la solution d’hybridation-fixation. Le surnageant est éliminé sur le rack magnétique, et les billes magnétiques sont reprises dans un mélange de 5 µl d’une solution de nitrate d’argent (2,4 mM) et 10 ml d’une solution de citrate de sodium, 1%. Les particules d’or servent de sites de nucléation pour la réduction du nitrate d’argent par le citrate de sodium, de la même manière que pour la synthèse d’un colloïde d’argent. Après 5 min de réaction, les billes magnétiques sont lavées avec une solution de 2xSSC, puis remises en suspension dans une solution de 4xSSC. Une étape d’élution standard de 20 min à 95°C est alors réalisée, et le signal SERRS de l’éluat est mesuré. Cette étape complémentaire de dépôt d’argent a été menée pour chaque condition

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expérimentale (sonde standard, AuNP, AuNP+TCEP) (Figure A1 - 3 b). Lors de l’utilisation des AuNP, le signal SERRS final est environ 9 fois plus élevé lorsque l’étape de dépôt d’argent a lieu, mais un signal non spécifique est observé lors des contrôles négatifs. Lors de l’utilisation des AuNP+TCEP, l’étape de silver enhancement entraine un signal SERRS 1,5 fois plus intense. Le protocole Hybridation-SERRS réalisé avec les AuNP+TCEP et complété par une étape de dépôt d’argent permet donc d’obtenir un signal 20 fois plus élevé que le protocole standard

Ce procédé est prometteur et permettra une efficacité accrue de la méthode en amplifiant le signal final.

Références bibliographiques

Ding, C. F., Q. Zhang, et al. (2009). "An electrochemical immunoassay for protein based on bio bar code method." Biosensors & Bioelectronics 24(8): 2434-2440.

Hill, H. D., C. A. Mirkin, et al. (2007). "Nonenzymatic detection of bacterial genomic DNA using the bio bar code assay." Analytical Chemistry 79(23): 9218-9223.

Lee, P. C. and D. Meisel (1982). "Adsorption and Surface-Enhanced Raman of Dyes on Silver and Gold Sols." Journal of Physical Chemistry 86(17): 3391-3395.

Nam, J. M., S. I. Stoeva, et al. (2004). "Bio-bar-code-based DNA detection with PCR-like sensitivity." Journal of the American Chemical Society 126(19): 5932-5933.

Storhoff, J. J., R. Elghanian, et al. (1998). "One-pot colorimetric differentiation of polynucleotides with single base imperfections using gold nanoparticle probes." Journal of the American Chemical Society 120(9): 1959-1964.

Thaxton, C. S., H. D. Hill, et al. (2005). "A bio-bar-code assay based upon dithiothreitol-induced oligonucleotide release." Analytical Chemistry 77(24): 8174-8178.

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I. Introduction

Les SNP, ou Single Nucleotide Polymorphism, sont de simples différences d’une base entre 2 séquences, trouvées chez plus d’1% de la population. Ils peuvent être des marqueurs de l’évolution génétique, par exemple pour l’étude de la domestication des chiens (Ollivier soumis). Les SNPs sont également impliqués dans le développement de maladies sévères telles que le diabète de type 2, les maladies d’Alzheimer et de Parkinson ou certains cancers (Kim and Misra 2007; Bichenkova, Lang et al. 2011), et peuvent également modifier la réponse d’un organisme à un traitement médicamenteux (Kim and Misra 2007).

Les SNP sont détectés par séquençage suivi d’un examen minutieux des séquences (Ollivier soumis), ainsi que par d’autres méthodes enzymatiques également utilisées en routine (Extension de Primers (PEC), clivage enzymatique, ligation ; Bichenkova 2011). Des méthodes de détection non-enzymatiques existent également, notamment la méthode dite d’hybridation, où un oligonucléotide marqué par une molécule fluorescente est hybridé à la séquence d’intérêt. Le signal de fluorescence n’est visible que s’il y a une parfaite hybridation. Une mismatch empêche l’hybridation.

Le SERRS étant plus sensible que la fluorescence (Faulds, Barbagallo et al. 2004; Sabatte, Keir et al. 2008), notre méthode pourrait être adaptée à la détection de SNP. Des méthodes de détection d’ADN par SERS sont déjà parvenus à la détection de mismatchs isolées (Cao, Jin et al. 2002; Thompson, Faulds et al. 2010). Notre méthode a le potentiel requis pour des études diagnostiques : elle est rapide, versatile, et permet de trancher facilement quant à la présence de l’ADN cible. Il serait très intéressant d’augmenter la spécificité de la méthode Hybridation-SERRS afin de pouvoir discriminer des séquences qui diffèrent entre elles d’une seule paire de bases (Kim and Misra 2007; Bichenkova, Lang et al. 2011), élargissant ainsi la gamme de diagnostiques possibles. Nous avons réalisé des tests préliminaires en étudiant avec

la méthode Hybridation-SERRS des séquences d’ADN simple-brin ne différent que d’1 ou de 2 bases.