Optimisation du protocole

I.1. Influence d’une hausse de température lors de l’étape de lavage

Plus la température d’une solution est élevée, plus l’hybridation des acides nucléiques est spécifique. On peut donc éliminer une partie de l’adsorption aspécifique en augmentant la température.

Nous avons choisi de ne faire varier que le protocole de lavage afin d’évaluer l’effet de la température sur la spécificité de la méthode. Les protocoles d’hybridation, fixation et élution ne varient pas. Les 2 étapes de lavage sont réalisées dans 150 µl de [0.1xSSC, 0.5% Tween20] à température constante de 25°, 30° ou 40° pendant 3 min. Seules les molécules N et C1-D1 sont ici analysées. Les résultats sont présentés en Figure A2-2.

Après des lavages à température ambiante, les signaux SERRS des molécules N et C₁-D₁ ne

diffèrent que de 10 %. Comme vu plus haut, il n’est pas possible de les discriminer efficacement. Une hausse de la température de lavage à 30°C permet d’obtenir une différence de signal SERRS plus importante de 66 %, tout en conservant un fort signal SERRS pour la molécule cible N. Une perte de 18% du signal est toutefois observée.

Figure A2-2: Effet d’une hausse de température du milieu de lavage sur la spécificité de

la méthode de détection. Les barres d’erreur représentent la déviation standard. (concentration des cibles : 5x10^-8 M, durée d’acquisition : 30 sec)

Des lavages effectués à 40°C accroissent la différence de signal observée entre le signal de la

molécule N et celui de la molécule C₁-D₁ , mais entrainent également une perte considérable

de signal, même pour la molécule N.

Les lavages à 30°C semblent donc être la meilleure option pour obtenir un signal SERRS suffisamment intense, tout en atteignant une spécificité accrue. Un test de la température de lavage entre 27 et 35° pourrait donner des résultats optimaux.

I.2. Optimisation de la salinité des milieux d’hybridation et de lavage

Nous avons testé différentes combinaisons de milieux d’hybridation et de lavage, afin d’améliorer la spécificité de la méthode de détection. La salinité du milieu d’hybridation a été variée entre 4xSSC et 1xSSC, et celle des milieux de lavages entre 0.1xSSC et 0.025xSSC. La concentration de Tween20 a été maintenue à 0.5%. Les conditions testées ainsi que leur nomenclature sont listées dans le Tableau A2-2.

Tableau A2-2: Combinaisons de salinité de milieux d’hybridation et de lavages testées

dans cette étude

Hybridation Lavage Nomenclature

4xSSC 4xSSC H4 - L4 0,1xSSC H4 - L0.1 0,05xSSC H4 – L0.05 0,025xSSC H4 – L0.025 2xSSC 0,1xSSC H2 - L0.1 0,05xSSC H2 - L0.5 0,025xSSC H2 - L0.025 1xSSC 0,1xSSC H1 - L0.1 0,05xSSC H1 - L0.05 0,025xSSC H1- L0.025

Les résultats Hybridation-SERRS de quelques combinaisons de salinités sont représentés en Figure A2-3 pour les molécules N et C1-D1.

Figure A2-3 : Résultats Hybridation-SERRS obtenus pour quelques combinaisons de

salinité a) H4 – L0.1 et - L0.05 b) H2 – L0.1 et - L0.05 et c) H1 – L0.1 et - L0.05. Les résultats ont été normalisés par rapport au signal des blancs. La bande grise représente 3 déviations standard des témoins. Tout signal supérieur à cette limite est positif. Concentration des cibles : 5x10^-8 M, durée d’acquisition : 30 sec.

Le signal de la molécule N diminue de 50 % lorsque la salinité d’hybridation est divisée par 4 (Figure A2-3). Cela indique une diminution de l’efficacité d’hybridation.

Lorsque la salinité du milieu d’hybridation est gardée constante, mais que l’on divise la salinité du milieu de lavage par 2, on observe systématiquement une baisse du signal pour la

molécule C1-D1, tandis que le signal obtenu pour la molécule cible N ne varie pas

significativement. La combinaison H1-L0.05 permet presque de ne détecter que la molécule cible N.

I.3. Augmentation du nombre de lavages

Nous avons envisagé qu’un plus grand nombre de lavages puisse dissocier un maximum de duplexes aspécifiques. Nous avons utilisé pour ce test la combinaison H2 – L0.025, avec des salinités des milieux d’hybridation et de lavage de 2xSSC et 0.025xSSC, respectivement. Le nombre de lavages est de deux, effectués à température ambiante afin de n’observer que l’effet du nombre de lavages. Les résultats sont présentés en Figure A2-4.

Figure A2-4 : Influence du nombre d’étapes de lavage sur la spécificité de la méthode.

Les salinités des milieux d’hybridation et de lavage sont de 2xSSC et 0.025xSSC, respectivement. La bande grise représente 3 déviations standards des témoins ; on considère comme détectées toutes molécules donnant lieu à un signal SERRS plus élevé que cette bande grise. (Concentration des cibles : 5x10^-8 M, durée d’acquisition : 30 sec).

Quel que soit le nombre de lavages, la molécule C1-D1 n’est pas détectée par la méthode. On

réussit donc à discriminer des molécules différant de 2 bases, situées respectivement dans la zone d’hybridation de la sonde de capture et de la sonde de détection SERRS. En revanche, la

molécule C0-D1 est détectée par notre méthode dans toutes les conditions testées. On note

toutefois une plus forte différence entre les molécules N et C₀-D₁ lorsque 3 lavages sont

effectués.

Nous sommes donc capables de discriminer 2 séquences très proches présentant 1 mismatch par sonde nucléique, mais pas encore des différences d’une seule base. Cependant, les tests préliminaires réalisés dans l’optique d’une augmentation de la spécificité de la méthode sont très encourageants. En combinant les paramètres salinité, température et nombre de lavages, la méthode SERRS- hybridation développée lors de cette thèse a le potentiel de devenir une méthode de détection des SNP. Elle pourra ainsi être utilisée pour réaliser des diagnostiques médicaux (Kim and Misra 2007). On pourra également l’utiliser pour l’étude d’ADN ancien (Ollivier soumis).

Références bibliographiques

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Cao, Y. W. C., R. C. Jin, et al. (2002). "Nanoparticles with Raman spectroscopic fingerprints for DNA and RNA detection." Science 297(5586): 1536-1540.

Faulds, K., R. P. Barbagallo, et al. (2004). "SERRS as a more sensitive technique for the detection of labelled oligonucleotides compared to fluorescence." Analyst 129(7): 567-568.

Kim, S. and A. Misra (2007). "SNP genotyping: Technologies and biomedical applications." Annual Review of Biomedical Engineering 9: 289-320.

Ollivier, M., Petit, Hitte, Hughes, Gillet, Duffraisse, Pionnier- Capitan, Lagoutte, Arbogast, Balasescu, Boroneant, Mashkour, Tresset, Vigne, Hänni (soumis). "Evidence of coat color variation sheds new ligth on ancient canids."

Sabatte, G., R. Keir, et al. (2008). "Comparison of surface-enhanced resonance Raman scattering and fluorescence for detection of a labeled antibody." Analytical Chemistry

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Thompson, D. G., K. Faulds, et al. (2010). "Precise Control of the Assembly of Dye-Coded Oligonucleotide Silver Nanoparticle Conjugates with Single Base Mismatch

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