Compléments expérimentaux

III.1. Résistance de la sonde SERRS aux hautes températures

Afin d’assurer la disponibilité de l’ADN cible pour une hybridation avec des sondes nucléiques spécifiques, une étape de dénaturation à haute température est nécessaire pour s’affranchir des éventuelles structures secondaires comme les épingles à cheveux, les boucles… L’hybridation s.s. s’effectue à une température proche de la Tm ou « melting

temperature » des sondes. Pour des oligonucléotides d’une vingtaine de bases, cette température est de 50°C environ.

Nous avons donc vérifié que la sonde R6G et son signal SERRS résistent à de telles températures. Pour cela, des aliquots de 30 µl d’une solution de la sonde Rup(R6G)3 de

concentration 8.7x10^-7 M sont placés dans un thermocycleur à température constante choisie

entre 50 et 92°C pendant 10 min, puis 1 minute à 22°C. Après un passage dans la glace immédiatement après la sortie du thermocycleur pour bloquer toute évolution du système, ces aliquots sont analysés en SERRS selon le protocole standard. Les spectres mesurés ont été traités grâce au logiciel Peakfit, afin d’obtenir l’aire A₁₆₅₀ du pic le plus intense caractéristique

de la R6G centré à 1650 cm^-1 et de quantifier l’évolution du signal SERRS. La solution

initiale analysée à température ambiante est utilisée comme référence pour normaliser le signal. L’évolution du signal SERRS en fonction de la température maximale appliquée pendant 10 min est présentée en Figure III-1.

Figure III-1 : Evolution en fonction de T max du signal SERRS représenté comme

l’aire A1650normalisée à celleà température ambiante.

On n’observe pas de changement significatif du signal, ce qui indique que le passage de la Rhodamine 6G à haute température jusqu’à 92°C n’entraine pas de perte de signal SERRS. Par conséquent, un protocole d’hybridation standard est possible.

III.2. Choix des séquences cibles

Nous avons choisi de travailler sur un modèle impliquant 2 espèces très proches, le chamois (Rupicapra rupicapra) et la chèvre (Capra hircus). La région ciblée est une partie de l’ADN mitochondrial, plus abondant que l’ADN nucléaire dans les cellules. Une cellule animale contient entre 800 et 1000 mitochondries, chacune ayant de 2 à 6 molécules d’ADN circulaire (Gardner 1984). Statistiquement, l’ADN le plus probable est donc l’ADN mitochondrial. De plus, l’ADN mitochondrial évolue plus vite que l’ADN nucléaire, ce qui permet d’obtenir sur une région de taille restreinte la variabilité nécessaire à la discrimination d’espèces proches. Nous nous intéressons plus particulièrement au gène codant pour l’ARN ribosomial 12S, dont l’étude permet d’identifier et de discriminer des séquences d’ADN proches (Girish, Anjaneyulu et al. 2004; Pegels, Gonzalez et al. 2011).

Les séquences des espèces d’intérêt, ici chamois et chèvre, sont téléchargées sur le site du NCBI (National Center for Biotechnology Information), qui met à disposition une

bibliothèque de toutes les parties de génomes séquencées jusqu’à présent en ligne (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). On utilise le logiciel Seaview (Galtier, Gouy et al. 1996; Gouy, Guindon et al. 2010), qui permet d’aligner manuellement ou automatiquement des séquences d’acides nucléiques ou de protéines. Les séquences peuvent être directement téléchargées en format FASTA, qui est lu par Seaview sans avoir besoin de le convertir au format texte.

Le but étant de travailler sur une séquence spécifique uniquement de l’espèce visée, on recherche une zone où la séquence d’intérêt présente plusieurs différences, ou mismatchs, par rapport aux séquences de contaminants courants, afin de limiter considérablement le risque de contaminations. Le principal contaminant à considérer est l’humain Homo sapiens. Le porc Sus scrofa, le bœuf Bos taurus, le poulet Gallus gallus… sont également considérés comme des contaminants universels, en raison de leur omniprésence dans notre alimentation. Nous avons ainsi choisi de travailler sur une séquence d’ADN mitochondrial de chamois (Rupicapra rupicapra) de 139 bases (gène du 12S RNA). Une séquence d’ADN mitochondrial de 138 bases de Capra hircus (chèvre), homologue à notre séquence d’ADN cible, sert de contrôle de spécificité de la méthode. Elle diffère de la séquence cible par 1 délétion et 14 mismatchs, dont seulement 4 sont situées dans la zone d’hybridation de la sonde de capture et 3 dans la zone d’hybridation de la sonde de détection. On étudiera donc des échantillons d’ADN cible, des échantillons d’ADN non-cible, ainsi que des mélanges de ces 2 séquences d’ADN.

III.3. Choix des sondes de capture et de détection

Il faut choisir des sondes de 20 bases environ qui vont devoir s’y hybrider à la séquence cible. Elles doivent être spécifiques de la séquence cible uniquement, et donc présenter des mismatchs par rapport aux séquences d’autres espèces.

En pratique, les sondes seront plus efficaces si les mismatchs sont situées au milieu de la sonde. En effet si la sonde tente de s’hybrider à de l’ADN non-cible, la présence de mismatchs au milieu induira un décollement des brins tandis que la présence de mismatchs à l’extrémité des sondes ne sera pas forcément décisive. Ceci diffère fortement du design d’amorces de PCR, où les mismatchs doivent être préférentiellement situées à l’extrémité 3’ afin que la Taq polymérase ne puisse pas initier l’élongation si le primer se fixe sur une séquence autre que la séquence d’intérêt.

Afin d’optimiser l’hybridation, les sondes sont choisies de préférence avec des températures d’hybridation proches. La température d’hybridation d’une séquence, ou T_m, est notamment

corrélée à la proportion de G et C.

La spécificité des séquences des sondes choisies est vérifiée grâce à l’outil BLAST, disponible en ligne (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Pour obtenir les résultats les plus complets possibles, sélectionner « Nucleotide, Other genomes ». Les séquences des sondes seront comparées à tous les génômes disponibles sur le site NCBI. Selon les résultats du BLAST, on valide ou non les sondes choisies.

On s’assure également que les séquences choisies ne s’autohybrident pas, ou ne forment pas de structures secondaires telles que des épingles à cheveux (hairpins) ou des boucles (loops) grâce à un calculateur en ligne (http://yellow.nist.gov:8444/dnaAnalysis/primerToolsPage.do) Cet outil calcule également la température d’hybridation optimale pour les séquences considérées.