Limitation des ADN-polymérases

Si l’analyse d’ADN ancien est de mieux en mieux comprise et de plus en plus efficace grâce au séquençage haut débit, de nombreux échantillons sont en apparence « stériles » et donnent lieu à un échec des amplifications et séquençage enzymatiques. En effet, les échantillons d’ADN anciens sont souvent dégradés, chimiquement modifiés, et cela complique l’obtention de séquences anciennes fiables, car les enzymes utilisées telles que la Taq polymerase sont sensibles à différents facteurs comme la présence d’inhibiteurs, de contaminants ou de lésions.

II.5.1 Présence d’inhibiteurs

Les enzymes de détection et d’amplification des molécules d’acides nucléiques sont très efficaces dans les conditions optimales mais voient leur activité diminuer en présence de substances dites inhibitrices. Ainsi, une absence totale d’amplification peut être observée (Wilson 1997), tout en n’étant pas liée à une absence d’ADN, mais à la présence d’inhibiteurs. Les inhibiteurs sont classés en 3 catégories (Radstrom, Knutsson et al. 2004).

- Inhibiteurs de l’ADN-polymérase : Un exemple souvent employé concerne les ions Mg²⁺ quisont des co-facteurs essentiels de l’enzyme. Tout composé monopolisant le stock d’ions Mg²⁺ ou empêchant leur interaction avec l’enzyme inhibera ADN polymérase (Wilson 1997; Bessetti 2007)

- Ceux qui dégradent l’ADN ou se fixent sur l’ADN empêchant la « lecture » du brin par l’enzyme.

- Ceux qui interfèrent avec la lyse des cellules lors de l’extraction de l’ADN, et donc qui empêchent la libération de l’ADN.

De nombreux inhibiteurs ont été identifiés tels que les acides humiques trouvés dans les sols, le collagène, les protéines du lait, les polysaccharides, et bien d’autres encore (Radstrom, Knutsson et al. 2004; Teletchea, Maudet et al. 2005; Bessetti 2007). Leur mécanisme d’inhibition n’est pas systématiquement connu (Radstrom, Knutsson et al. 2004). Les inhibiteurs sont souvent co-extraits de l’échantillon avec l’ADN. Plusieurs solutions sont possibles afin de les éliminer. Il existe des kits de purification commerciaux (e.g. Promega, Qiagen) qui reposent usuellement sur la forte adsorption de l’ADN en surface de billes de silice permettant d’isoler l’ADN des contaminants et inhibiteurs. On peut répéter plusieurs fois l’étape d’extraction d’ADN sur silice pour optimiser la soustraction des inhibiteurs (Kemp, Monroe et al. 2006).

L’utilisation de la protéine BSA (Bovine Serum Albumin) lors de la réaction de PCR permet également de limiter les inhibitions (Kreader 1996), et est donc très utilisée lors de l’étude d’ADN ancien.

II.5.2 Contamination

Lorsque l’on travaille à l’amplification enzymatique d’un substrat ancien, le risque d’une contamination externe ne peut pas être négligé. En effet, les dégradations de l’ADN ancien

molécule moderne présente dans le tube. Outre la possibilité d’une contamination inter-échantillon par aérosol lors de la préparation de plusieurs inter-échantillons en parallèle, des contaminants universels (Bœuf, Porc, Mouton, Homme…) présents dans l’atmosphère ou sur l’expérimentateur peuvent être amplifiés. Ceci a parfois donné lieu dans les années 1990 à des conclusions hâtives et erronées. Woodward et al. (1994) prétendent avoir analysé une séquence d’ADN de dinosaure du Crétacé (65 Ma). Rapidement, d’autres études prouvent que cette séquence est en réalité une séquence de mammifère, plus particulièrement d’ADN mitochondrial humain (Zischler, Hoss et al. 1995). La recherche d’ADN d’âge « géologique » continue cependant, avec des découvertes pas toujours confirmées (Hebsgaard, Phillips et al. 2005). Des erreurs rencontrées lors de cette « course à l’ADN le plus vieux » a émergé la nécessité de mettre au point des règles strictes afin d’éviter les contaminations, de s’assurer de l’endogénicité et de l’authenticité des séquences obtenues lors de l’analyse d’ADN ancien (Cooper and Poinar 2000). Ces règles sont appliquées strictement sur la plateforme de paléogénétique de Lyon.

II.5.3 Incapacité à traiter certaines lésions

Malgré toutes les précautions prises, la PCR n’aboutit pas pour une large variété d’échantillons. Cela ne signifie cependant pas forcément que l’ADN cible n’est pas présent dans l’échantillon. En effet, une limitation majeure des ADN-polymérases est leur incapacité parfois, ou tout du moins leur difficulté à traiter un substrat dégradé. L’ADN cible peut donc être présent dans l’échantillon, peut être même en quantité importante sans être accessible à l’analyse enzymatique. Il existe 2 types de lésions.

! Lésions non-bloquantes

Elles n’empêchent pas la lecture de la molécule ni son amplification, mais elles entrainent des erreurs dans la séquence finale (Hofreiter, Paabo et al. 2001; Briggs, Stenzel et al. 2007). Ces modifications chimiques subies par les bases entrainent des mésappariements ; or, la

Taq-polymérase ne dispose pas d’un système de lecture et de correction des erreurs au fil de l’élongation.

Dans des substrats anciens, la lésion la plus courante entrainant un mésappariement est la désamination de la cytosine, formant alors une Uracile (Figure I-3). L’ADN-polymérase place alors une Adénosine en face de cette Cytosine désaminée à la place d’une Guanosine. La transition de C vers U dans la molécule « modèle » entraine donc une transition de G vers A dans la nouvelle molécule.

Les cytosines ont également tendance à se « méthyler » au niveau du carbone 5 (10 à 30% des cytosines dans une cellule vivante (Brown 2011). Si la base 5-méthyl-Cytosine s’apparie toujours avec la Guanosine, elle est encore plus sujette à la désamination que ne l’est la Cytosine. Le résultat de la désamination d’une Cytosine méthylée est une Thymine ; on observe donc beaucoup de transitions C vers T dans le substrat, et donc d’autant plus d’erreurs de codage de G vers A dans la séquence amplifiée.

D’autres bases modifiées sont également responsables de mésappariement et d’erreurs de codage. Le résultat de la désamination d’une Adénine, appelée Hypoxanthine, s’appariera ainsi plus volontiers avec une Cytosine qu’une Thymine. Ces modifications de séquences sont cependant beaucoup moins fréquentes dans l’ADN ancien que la désamination de C vers U ; elles ne représentent que 2 à 3% de la désamination de la cytosine (Brown 2011). Toutes les désaminations ne sont cependant pas à l’origine d’erreurs de codage ; par exemple la Xanthine, produit de désamination de la Guanosine, s’apparie bien avec la Cytosine et n’entraine donc pas de modifications dans la séquence finale.

L’oxydation des bases peut également entrainer un « miscoding ». Par exemple, la 8-Hydroxyguanine s’apparie avec l’Adénine et non avec la Cytosine (Cheng 1992) ; on observe donc des transitions de G vers T dans les séquences amplifiées.

Parmi toutes les lésions non-bloquantes, Brotherton et al. (Brotherton 2007) suggèrent que seule les désaminations de C en U entraine une quantité importante de modifications, les autres étant plus anecdotiques.

! Lésions bloquantes

Parmi les produits d’une réaction de PCR sur un échantillon dégradé ou ancien, il n’est pas rare d’obtenir des séquences plus courtes que la séquence ciblée, ou de n’obtenir aucune amplification. Des lésions de l’ADN peuvent stopper l’élongation de la molécule par l’ADN polymérase, bloquant ainsi la réaction de PCR. On les appelle les lésions bloquantes.

La fragmentation des molécules peut bien sûr être responsable de l’obtention d’amplicons plus courts que la séquence cible. On prend donc soin de cibler des fragments courts de l’ordre de 200 bp. Plusieurs types de modifications oxydatives des bases azotées bloquent l’élongation de la molécule d’ADN par la Taq-polymérase (Höss et al., 1996), dont les

pyrimidines oxydées, ou hydantoïnes. L’abondance d’hydantoïnes dans les échantillons, par

exemple, est corrélée à l’inefficacité de la PCR à amplifier les séquences en présence (Heyn, Stenzel et al. 2010). D’autres bases modifiées telles que la 8-oxo-7,8-dihydro-20-deoxyadenosine réduisent également drastiquement l’efficacité de la PCR de plus de 85% (Sikorsky, Primerano et al. 2004).

Les crosslinks, intermoléculaires ou intramoléculaires, sont également des lésions bloquantes formées par alkylation ou par la réaction de Maillard (Willerslev et Cooper, 2005). Ces dernières sont des blocages mécaniques au traitement des molécules par la Taq-polymérase (Willerslev et Cooper, 2005 ; Pääbo et al., 2004).

Enfin, de nombreuses études montrent que la présence de sites abasiques, résultats de la dépyrimidination et surtout de la dépurination, bloque l’activité de l’enzyme (McDonald, Hall et al. 2006). Le résultat d’amplification de substrat contenant des sites abasiques dépendra du type d’enzyme utilisé et de sa sensibilité vis à vis de telles lésions. Schaaper et al. (1983)

étudient la polymérase E. coli ADN I, et observent que plus la quantité de sites abasiques augmente, plus l’enzyme peine à traiter les molécules, abaissant l’efficacité d’amplification. Sikorsky et al. (2004, 2007) observent que l’efficacité de la PCR par Taq polymérase est réduite de 95 à 98% par la présence d’un seul site abasique. Dans les deux cas, les séquences obtenues ne sont pas fidèles au substrat initial et contiennent des erreurs de codage et des suppressions de bases (Schaaper, Kunkel et al. 1983; Shibutani, Takeshita et al. 1997; Sikorsky, Primerano et al. 2007). Haracska et al. (2001)montrent que l’ADN-polymérase η est incapable de traiter des molécules d’ADN contenant un site abasique.

La présence de lésions bloquantes comme les sites abasiques ou les coupures de brins favorise également la « jumping PCR » (Paabo, Irwin et al. 1990), un artéfact d’amplification pouvant entrainer la synthèse de séquences plus longues que la séquence ciblée (Figure I-7, d’après Orlando et Hänni, 2000). La Jumping PCR peut également contribuer aux erreurs de séquence (Hofreiter et al., 2001).

Figure I-7 : Jumping PCR, artéfact d’amplification fréquent dans l’étude d’ADN ancien

(d’après Päabo et al., 1990 et Orlando et Hänni, 2000). Le fragment ciblé n’est pas forcément présent dans l’échantillon. L’ADN polymérase va donc créer des molécules chimères en combinant plusieurs fragments qui se recoupent. Le résultat d’amplification peut par conséquent être plus long que la séquence ciblée.