Réduction de l’adsorption non spécifique

IV.1.1. Optimisation de l’étape de lavage

Nous avons optimisé l’étape de lavage afin d’éliminer la variabilité des témoins.

Le volume de milieu de lavage utilisé pour rincer les billes est compris entre 150 et 200 µl afin que les billes soient constamment immergées même lorsque l’on les immobilise sur le rack magnétique. Cela permet d’être certain que toutes les billes ont été lavées, ce qui n’est pas forcément le cas si une partie des billes est immobilisée au dessus de la surface du liquide. De plus, plus le volume de lavage est grand, plus il permet de diluer d’éventuelles traces résiduelles, améliorant également la spécificité de notre méthode.

Une seule étape de lavage mène parfois à l’obtention d’un fort signal SERRS de R6G même lors de l’analyse d’un échantillon dépourvu d’ADN cible. La totalité des molécules non-hybridées n’est donc pas systématiquement éliminée dès le premier lavage. Nous avons montré que les solutions du 3è lavage sont systématiquement vides du signal SERRS de la Rhodamine 6G. Cela indique une élimination totale des molécules non-spécifiquement fixées au deuxième lavage. Notre protocole comprend donc deux étapes de lavage.

IV.1.2. Composition du milieu de lavage et ajout d’un surfactant

Afin de s’affranchir de l’adsorption non-spécifique et ainsi ne pas risquer d’obtenir des résultats « faux positifs », nous avons testé différents milieux d’hybridation et de lavages. L’ajout d’un surfactant, le Tween 20 ou Polysorbate 20, permet de s’affranchir de la majorité de cette adsorption aspécifique. L’utilisation de Tween 20 est préconisée par l’équipe de Graham (Faulds, Graham et al. 2004). La CMC (Critical Micell Concentration) du Tween 20 étant de 0.059 mM (0.0072 %), des micelles ne se forment qu’au dessus de cette concentration limite. On se placera donc à 0.05 % en Tween 20. Deux milieux de lavage ont été testés avec et sans surfactant, une solution de SSC et une solution d’éthanol. Les tests ont été effectués sur des échantillons témoins ne contenant pas d’ADN cible mais uniquement la sonde de détection. L’hybridation et la fixation se font toujours à salinité 4xSSC. Les résultats sont présentés en Figure III-2.

Figure III-2: Réduction de l’adsorption non-spécifique par ajout de Tween 20 dans

les milieux d’hybridation et de lavage. a) Lavages en 4xSSC; b) Lavages en éthanol. Les spectres ont été acquis pour des échantillons de sonde Rup(R6G) seule. Durée d’acquisition : 1x10s

Quand l’hybridation, la fixation et le lavage sont réalisées dans un milieu simple de 4xSSC sans surfactant, on observe un très fort signal de R6G ; le pic à 1650 cm^-1 est très marqué

(Figure III-2 a). Cela indique une forte adsorption de la sonde de détection sur les billes magnétiques à fonction streptavidine. Quand l’étape de lavage est réalisée avec de l’éthanol au lieu de la solution saline 4xSSC (Figure III-2 b), on observe toujours un signal de R6G, mais son intensité est moindre. L’utilisation d’éthanol semble donc limiter l’adsorption non-spécifique de la sonde de détection sur les billes magnétiques.

L’ajout au milieu d’hybridation et de fixation du Tween 20 en concentration 0,05% induit une baisse d’intensité du signal de la R6G si on réalise l’étape de lavage avec une solution d’éthanol (Figure III-2 b). Le signal persiste toutefois. L’utilisation de Tween 20 combinée avec une solution saline de 4xSSC conduit à une disparition totale du signal de la R6G (Figure III-2 a) indiquant que l’adsorption non-spécifique de la sonde sur les billes magnétiques est totalement supprimée.

Nous avons testé ces conditions expérimentales sur des échantillons d’ADN simple brin de R.

rupicapra. Des échantillons dépourvus d’ADN cible ont également été analysés comme

contrôle négatif. Les spectres SERRS correspondant sont présentés en Figure III-3. On observe un fort signal de R6G en présence d’ADN cible (spectre a). Si l’ADN cible n’est pas présent dans l’échantillon de départ, le spectre SERRS (spectre b) ne présente aucun pic caractéristique de la R6G. On n’y observe que les pics caractéristiques de la cuvette en PMMA, annotés ici d’une étoile bleue. On a donc éliminé toute contribution d’adsorption non-spécifique de la sonde de détection durant les expériences d’hybridation-fixation-lavage-élution.

Figure III-3 : Spectres SERRS obtenus en utilisant le protocole optimisé incluant

l’utilisation de Tween 20 ; a) ADN simple brin de R. rupicapra, concentration 1x10^-7 M ; b) Témoin, pas d’ADN cible. Durée d’acquisition = 1x10s.

IV.1.3. Elimination de l’hybridation non-spécifique

Une contribution parasite au signal SERRS peut provenir d’une hybridation non-spécifique de la sonde de détection à une séquence d’ADN non-cible. Or, la spécificité d’une hybridation est fortement influencée par la température, la salinité et le pH de la solution. On parle de stringence d’une solution, ou de sa capacité à influencer le processus d’hybridation des acides nucléiques. À fortes températures, faible salinité, la stringence est forte et maintenir une hybridation requiert une grande complémentarité des séquences ; les hybridations sont donc spécifiques. À faible température, forte salinité, la stringence est faible et les hybridations sont favorisées même si la complémentarité entre les brins est moins grande, menant ainsi à une contribution non-négligeable d’hybridations non-spécifiques.

Nous avons optimisé la spécificité en jouant sur la salinité des tampons, qui est le paramètre le plus facile à manipuler.

On agit uniquement sur la salinité du milieu de lavage. La Figure III-4 présente les spectres SERRS obtenus pour des échantillons d’ADN non-cible (Capra hircus) en utilisant différentes salinités du milieu de lavage entre 4xSSC et 0.1xSSC. Tous contiennent du Tween 20, 0.05 wt%.

Figure III – 4 : Effet de la salinité du milieu de lavage sur l’hybridation non-spécifique. Les expériences ont été réalisées avec de l’ADN simple brin de C. hircus

(5x10^-8 M) en effectuant 2 étapes de lavage. Les salinités des milieux de lavages sont annotées au dessus des spectres. Durée d’acquisition = 1x30 sec ; Concentration en Tween 20 = 0.05%.

Quand le milieu de lavage est à la même salinité que le milieu d’hybridation-fixation, i.e. 4xSSC (spectre a), on observe très nettement les pics caractéristiques de la sonde de détection. Pourtant, il n’y a pas d’adsorption non-spécifique car le témoin ne présente aucun signal de R6G (spectre d). Cela indique une forte hybridation non-spécifique des sondes de capture et de détection à la séquence de C. hircus malgré les mismatchs. La salinité des liquides de lavages a été progressivement abaissée. L’intensité du signal SERRS de la sonde de détection diminue lorsque l’on abaisse la salinité du milieu de lavage, indiquant que les sondes de

détection s’hybrident de moins en moins à l’ADN non-cible. À des salinités de 0.25xSSC et 0.1xSSC, on n’observe plus les pics caractéristiques de la R6G, ce qui indique une efficacité totale des étapes de lavages. Des échantillons d’ADN cible R. rup. analysés avec ces protocoles de lavages résultent en des signaux SERRS de R6G de même intensité. On peut donc réaliser les expériences avec l’une ou l’autre des salinités.

La méthode Hybridation-SERRS développée dans ce chapitre permet la détection spécifique et quantitative de séquences d’ADN simple brin. Elle est totalement non-enzymatique, et n’est donc pas limitée par les dégradations du substrat, ce qui élargirait considérablement la gamme d’échantillons analysables, notamment en paléogénétique. Nous avons ainsi fait un premier pas très prometteur vers la détection d’ADN naturel, moderne ou ancien. Toutefois, l’ADN d’un échantillon naturel, moderne ou ancien, est sous forme double-brin. Le chapitre suivant rapporte donc le développement d’une méthode de détection d’ADN double-brin.

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Chapitre 4