Réplication de l’ARN du VHC

Le VHC, comme tous les virus à ARN simple brin de polarité positive, forme un complexe de réplication avec les protéines non structurales néosynthétisées associées aux membranes cellulaires (Salonen et al., 2005). La réplication commence par la synthèse, par NS5B, d’un brin d’ARN négatif complémentaire du brin d’ARN positif, qui sera la matrice pour la réplication du génome en de multiples copies. Ces brins d’ARN positifs nouvellement synthétisés serviront soit à la synthèse des protéines virales, soit à l’encapsidation dans de nouvelles particules virales. Les protéines non structurales, associées à la membrane du RE, forment le complexe de réplication. Des altérations spécifiques des membranes cellulaires au niveau du RE, appelées « membranous web » ont été identifiées comme étant les sites de réplication de l’ARN viral (Egger et al., 2002; Gosert et al., 2003). Bien que le mécanisme de la régulation de la synthèse de l’ARN viral ne soit pas encore entièrement élucidé, un nombre important de facteurs viraux mais aussi de facteurs de la cellule hôte ont été identifiés en tant que régulateurs de la réplication de l’ARN viral.

Le complexe de réplication 2.6.3.1

L’expression des protéines non structurales (NS3, NS4A, NS4B, NS5A et NS5B) est nécessaire et suffisante à la réplication de l’ARN du VHC (Lohmann et al., 1999). De nombreuses

Le « membranous web » 2.6.3.2

Figure 17. « Membranous web » observé en microscopie électronique. (Moradpour et al., 2007) a,

observation de cellules Huh-7 répliquant le réplicon sous-génomique du VHC. Des altérations membranaires sont observées à proximité du noyau, nommées « membranous web » (flèches). La barre d’échelle représente 1 μm. B, Grossissement de la zone « membranous web » composé de petites vésicules intégrées dans une matrice membranaire situé à proximité du RE. La barre d’échelle représente 500 nm. Le « membranous web » contient toute les protéines non structurales et l’ARN néosynthétisé. ER, endoplamsic retculum ; M, mitochondrie ; N, noyau.

L’infection par le VHC mène à la formation et à l’accumulation de vésicules particulières dérivées du RE pour former un réseau membranaire appelé « membranous web » où est localisé le complexe de réplication du VHC (Figure 17). Ce réseau membranaire a été mis en évidence pour la première fois en 2002 par microscopie électronique (Egger et al., 2002) par expression des protéines virales dans des lignées cellulaires sans réplication de l’ARN viral. Ceci a été confirmé par d’autres modèles d’études in vitro (voir paragraphe 2.7.1), le réplicon sous- génomique du VHC (Gosert et al., 2003) et le modèle HCVcc (Rouillé et al., 2006). La localisation des protéines non structurales par immunofluorescence a révélé leur distribution au sein de ce réseau membranaire avec de l’ARN nouvellement formé (Gosert et al., 2003). Il a été montré que ce réseau membranaire dérive du RE où les protéines virales sont exprimées. Par analogie avec les virus de la même famille, il semble que ces vésicules membranaires sont des invaginations de la membrane du RE, connectées avec le cytoplasme par de petits pores permettant l’échange de petites molécules non perméables à la membrane comme des nucléotides nécessaires à la synthèse de l’ARN (Welsch et al., 2009). Il a été montré que la majorité des membranes issues d’une altération par l’infection du VHC n’était pas des vésicules composées d’une membrane unique. Ce serait des structures plus complexes composées de deux ou plusieurs membranes nommé respectivement DMV (double-membrane vesicles) et MMV (multi- membrane vesicles) (Ferrari et al., 2008; Reiss et al., 2011). L’ARN viral et les protéines NS

retrouvées à l’intérieur de ces DMVs ainsi que leur abondance en corrélation avec le taux de réplication de l’ARN viral, montre leur rôle fonctionnel. (Romero-Brey et al., 2012).

Figure 18. Observation en microscopie électronique de DMVs et MMVs (Romero-Brey et al., 2012).

A, 36h et B, 48h après infection par l’ARN bicistronique du système réplicon sous-génomique du VHC. Les carrés jaunes indiquent la zone montrée sur la droite à un plus fort grossissement. DMV, Double

Membrane Vesicles ; MMV, Multi Membrane Vesicles ; ER, Endoplasmic Reticulum.  Morphogénèse du « membranous web » : facteurs viraux

NS4B a été identifiée comme étant la principale protéine responsable de la mise en place du « membranous web », en effet son expression seule induit la formation des mêmes structures que lorsque l’ensemble des protéines NS sont exprimées (Egger et al., 2002). L’oligomérisation de NS4B pourrait déclencher la formation des membranes vésiculaires (Paul et al., 2011). Il a en effet été montré que des mutations au sein de NS4B empêchant son oligomérisation gêneraient des structures DMVs anormales (Paul et al., 2011). NS4B ne serait pas la seule protéine responsable de la morphogénèse du « membranous web », en effet l’expression seule de NS3-4A, NS5A et NS5B donnent également des réarrangements vésiculaires (Romero-Brey et al., 2012). NS3-4A, et NS5B induisent des vésicules composées d’une membrane unique, différentes des DMVs et MMVs observés lors de l’expression complète des protéines de NS3 à NS5B (Romero- Brey et al., 2012). Par opposition, NS5A induit la formation de vésicules contenant plusieurs

A

Des études ont montré la contribution de nombreux facteurs de la cellule hôte dans la formation du « membranous web ». La phosphatidylinositol 4-kinase III alpha (PI4KIIIα) a été identifiée par siRNA comme un facteur cellulaire essentiel pour la réplication de l’ARN du VHC (Tai et al., 2009; Reiss et al., 2011). Elle est recrutée par le domaine 1 de NS5A. Cette interaction favorise son activité de kinase lipidique, permettant d’augmenter le taux de phosphatidylinositol 4- phosphate (PI4P) intracellulaire nécessaire à la formation du réseau membranaire (Berger et al., 2011). La formation des DMVs est inhibée par des inhibiteurs de Cyclophiline et de NS5A. Par contre les inhibiteurs de NS5B, ou de mir 122 n’empêchent pas la formation des DMVs (Chatterji et al., 2015). Par ailleurs, la réplication du cycle cellulaire du VHC est dépendante des lipides de la cellule hôte (Alvisi et al., 2011). Le VHC perturbe l’expression de gènes impliqués dans le métabolisme lipidique, ce qui induit une accumulation intracellulaire de lipides nécessaires à la réplication de l’ARN viral (Diamond et al., 2010).

Le mécanisme de réplication 2.6.3.3

 Facteurs viraux

Le mécanisme de réplication de l’ARN viral orchestré par le complexe de réplication n’est pas encore entièrement élucidé. L’environnement membranaire procuré par le « membranous web » serait favorable aux interactions protéines-protéines nécessaires à la réplication de l’ARN viral. L’activité hélicase/NTPase de la protéine NS3 servirait à séparer les brins d’ARN positifs et négatifs de l’ARN viral et à abolir les structures secondaires des ARN (IRES et régions X de l’extrémité 3’non codante) permettant ainsi à l’ARN polymérase NS5B d’accéder aux structures très repliées de l’ARN.

NS5A joue aussi un rôle essentiel dans la réplication du VHC, cependant sa fonction dans le cadre de la réplication de l’ARN viral est mal connue. Il a été montré que cette protéine est indispensable à la réplication du génome viral notamment via son interaction avec l’ARN viral au niveau de son domaine D1 (Tellinghuisen et al., 2004; Tellinghuisen et al., 2005; Love et al., 2009). Le domaine 2 de NS5A est également indispensable à la réplication du génome du VHC, et possède des résidus essentiels à la réplication virale (Tellinghuisen et al., 2007).

 Facteurs de la cellule hôte

De nombreuses protéines cellulaires interviennent dans la réplication de l’ARN. En effet, des études ont montré l’importance de nombreux protéines cellulaires dans le mécanisme de réplication de l’ARN, notamment le rôle de protéines appartenant à la famille des Immunophilines (Watashi et al., 2005; Okamoto et al., 2006).

La CypA est requise pour la réplication du VHC (Kaul et al., 2009; Chatterji et al., 2009; Yang et al., 2008). FKBP8, une protéine appartenant à la famille des FK506-binding protein (FKBP), et la protéine chaperonne Hsp90, formeraient un complexe avec la protéine NS5A qui aurait un rôle important dans la réplication de l’ARN viral (Okamoto et al., 2006).