display sites chaperones effectors assemblers scavengers
1 Caractérisation moléculaire d’un petit motif structural au sein du domaine 2 désordonné de
NS5A
1.1 Résumé
Cette introduction résume les travaux qui font l’objet d’une publication dans la revue Journal of Biological Chemistry intitulé: « A Proline-Tryptophan Turn in the Intrinsically Disordered Domain 2 of NS5A Protein is Essential for Hepatitis C Virus RNA Replication » (section 1.2). Ces travaux ont été réalisés sur NS5A-D2 de la souche Con1 du VHC (245-341). Il a été montré que NS5A-D2 est globalement désordonné avec toutefois la présence de régions qui ont tendance à se structurer en hélices α. Notre étude avec notamment, l’analyse des déplacements chimiques secondaires par la méthode ncIDP a permis de mettre en évidence la présence d’un petit motif structural au sein de NS5A-D2 (Con1) centré au niveau des résidus W316 et A317.
Le motif structural au sein de NS5A-D2 a été caractérisé à l’aide d’un modèle peptidique afin de réduire la complexité des spectres. Le peptide de NS5A-D2 (Con1) (pepD2(Con1)) utilisé est un peptide de 20 résidus correspondant au site d’interaction avec la CypA : 308KFPRAMPIWARPDYNPPLLE327
. Ce site d’interaction de 20 résidus correspond à la séquence la plus conservée du domaine parmi tous les génotypes du VHC (Figure 54A).
250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 | | | | | | | | | | NS5A-D2 Con1 DSPDADLIEANLLWRQEMGGNITRVESENKVVILDSFEPLQAEEDEREVSVPAEILRRSRKFPRAMPIWARPDYNPPLLESWKDPDYVPPVVHGCPLP
strictement conservés (*); les résidus fortement conservés (;); et les résidus similaires (.). Le site d’interaction avec la CypA correspond à la séquence la plus conservée parmi tous les génotypes du VHC. B, Séquence du peptide de D2 Con1 (pepD2 Con1) utilisé pour réaliser l’analyse structurale et fonctionnelle de la microstructure. Ce peptide de 20 résidus contient 5 prolines indiquées en rouge
Afin d’obtenir des données RMN expérimentales pour caractériser la conformation locale particulière de NS5A-D2 nous avons produit par voie recombinante chez Escherichia Coli ce peptide de 20 résidus marqué en 15N et en 13C. Les résultats de cette partie sont détaillés dans la section (1.3). Ceci a permis de compléter les données expérimentales obtenues précédemment avec ce peptide non marqué produit par synthèse chimique par la société Gencust. Voici les différentes expériences RMN utilisées sur ce peptide de 20 résidus marqués 15N 13C et non marqué:
Des spectres 1H-15N HSQC, 1H-13C HMQC, HNCACB, HNCOCACB, HNCO, HNN ont été utilisés afin d’obtenir les déplacements chimiques 1H, 15N et 13C.
Des spectres TOCSY et NOESY nous ont permis d’obtenir tous les déplacements chimiques protons et des contacts NOE permettant d’obtenir des contraintes de distances. Toutes les données expérimentales obtenues par RMN sur ce peptide ont été utilisées dans un protocole de modélisation sous contraintes expérimentales, réalisé en collaboration avec le laboratoire du Dr. François Penin (IBCP, Lyon). Le modèle structural obtenu par RMN est centré sur la séquence 314PIWA317, il forme un turn hydrophobe où la chaine latérale du tryptophane W316 interagit avec le cycle de la proline P314. Un petit motif structural, PW-turn, a donc été mis en évidence au sein d’un domaine désordonné : NS5A-D2.
Ce motif structural a permis de mieux comprendre la conservation de séquence des résidus impliqués dans le motif. En effet la P314, le W316 et l’A317 sont strictement conservés parmi tous les génotypes du VHC et sont directement impliqués dans la formation de la microstructure (Figure 54A). A l’inverse l’isoleucine I315 n’est pas un résidu conservé, il existe une certaine variabilité parmi tous les génotypes du VHC à cette position, qui peut s’expliquer par la structure du motif puisque la chaine latérale de l’isoleucine n’est pas directement impliquée dans la stabilisation de la microstructure, elle est dirigée vers l’extérieur du motif. Parmi tous les génotypes du VHC il n’y a jamais de glycine à cette position 315. De plus, des recherches dans la PDB ont montré que la présence d’une glycine à cette position n’était pas favorable à la présence de la microstructure. Nous avons donc muté ce résidu d’isoleucine 315 en glycine en espérant que cette mutation I315G casse le motif structural. Les analyses RMN réalisées sur le domaine mutant NS5A-D2 I315G ainsi que sur le peptide de 20 résidus (K308-E327) muté en I315G montrent bien que cette mutation ponctuelle casse la microstructure.
Cette mutation I315G a permis de montrer que le motif structural a une importance fonctionnelle puisque dans le test cellulaire de réplication sous-génomique de l’ARN viral, réalisé en collaboration avec le Pr. Bartenschlager (Department of Molecular Virology, Heidelberg, Germany), la mutation I315G abolit la réplication de l’ARN viral à un niveau comparable à celui du témoin négatif où l’ARN polymérase virale est non fonctionnelle. Cette microstructure est donc strictement requise pour la réplication de l’ARN viral.
Afin de comprendre par quel(s) mécanisme(s) moléculaire(s) le motif structural intervient dans la réplication de l’ARN viral, nous avons cherché à savoir s’il a une importance pour l’interaction avec la CypA puisque ce motif est localisé au centre de la zone d’interaction avec la CypA. Nous avons effectué des expériences de titration sur la CypA 15N par ajouts croissants de peptides pepD2(Con1) WT ou I315G non marqués. La comparaison des constantes de dissociation (KD) montre que l’affinité entre le peptide et la CypA est plus faible en présence de la mutation I315G, le motif est donc impliqué dans l’interaction avec la CypA.
Toujours dans le but d’évaluer l’importance fonctionnelle du motif structural au sein de NS5A- D2, nous avons analysé l’activité PPIase de la CypA directement sur les résidus de prolines localisés dans la région (308-327) de NS5A-D2. Des expériences d’échanges CaZNZ permettant d’étudier l’activité PPIase de la CypA directement sur les résidus de prolines ont été enregistrées de manière comparative sur les peptides, doublement marqués 15N 13C, pepD2-WT et pepD2- I315G. Cette analyse a permis de montrer que l’isomérisation cis/trans de la proline P314 catalysée par la CypA est plus rapide lorsque le motif structural est absent (mutant I315G). Ceci suggère que ce serait plutôt la liaison du motif structural à la CypA qui serait important pour la réplication du génome viral plutôt que l’isomérisation cis/trans de la proline P314.