Expression et purification des protéines

2.1.1 Clonage, expression et purification des domaines recombinants

NS5A-D2 WT et mutants.

(LQHHHHHH) qui serviront à purifier les protéines recombinantes par chromatographie d’affinité sur une colonne chargée en nickel (Ni2+_).

Mutagénèse dirigée 2.1.1.2

Nous avons créé par mutagénèse dirigée les vecteurs d’expression correspondant aux différents mutants de NS5A-D2 (JFH1). La liste des mutants créés est présentée Figure 63.

Figure 63. Liste des mutants de NS5A-D2 (JFH1) exprimés chez E. coli. La mutation est indiquée en

rouge, la région surlignée en jaune correspond au site d’interaction avec la CypA.

Mutations de résistance à des inhibiteurs de CypA

NS5A-D2 D316E NTYDVDMVDANLLMEGGVAQTEPESRVPVLDFLEPMAEEESDLEPSIPSECMLPRSGFPRALPAWARPEYNPPLVESWRRPDYQPPTVAGCALPP 248...260...270...280... 290.. 300...310...320...330...340 NS5A-D2 DEYN NTYDVDMVDANLLMEGGVAQTEPESRVPVLDFLEPMAEEESDLEPSIPSECMLPRSGFPRALPAWARPENNPPLVESWRRPDYQPPTVAGCALPP 248...260...270...280... 290.. 300...310...320...330...340

Mutations Proline –Alanine et A311G NS5A-D2 P306A NTYDVDMVDANLLMEGGVAQTEPESRVPVLDFLEPMAEEESDLEPSIPSECMLPRSGFARALPAWARPDYNPPLVESWRRPDYQPPTVAGCALPP 248...260...270...280... 290.. 300...310...320...330...340 NS5A-D2 P310A NTYDVDMVDANLLMEGGVAQTEPESRVPVLDFLEPMAEEESDLEPSIPSECMLPRSGFPRALAAWARPDYNPPLVESWRRPDYQPPTVAGCALPP 248...260...270...280... 290.. 300...310...320...330...340 NS5A-D2 P315A NTYDVDMVDANLLMEGGVAQTEPESRVPVLDFLEPMAEEESDLEPSIPSECMLPRSGFPRALPAWARADYNPPLVESWRRPDYQPPTVAGCALPP 248...260...270...280... 290.. 300...310...320...330...340 NS5A-D2 P319A NTYDVDMVDANLLMEGGVAQTEPESRVPVLDFLEPMAEEESDLEPSIPSECMLPRSGFPRALPAWARPDYNAPLVESWRRPDYQPPTVAGCALPP 248...260...270...280... 290.. 300...310...320...330...340 NS5A-D2 P320A NTYDVDMVDANLLMEGGVAQTEPESRVPVLDFLEPMAEEESDLEPSIPSECMLPRSGFPRALPAWARPDYNPALVESWRRPDYQPPTVAGCALPP 248...260...270...280... 290.. 300...310...320...330...340 NS5A-D2 A311G NTYDVDMVDANLLMEGGVAQTEPESRVPVLDFLEPMAEEESDLEPSIPSECMLPRSGFPRALPGWARPDYNPPLVESWRRPDYQPPTVAGCALPP 248...260...270...280... 290.. 300...310...320...330...340

Mutations Cystéine-Sérine et A311G Cystéine-Sérine

NS5A-D2 C298S NTYDVDMVDANLLMEGGVAQTEPESRVPVLDFLEPMAEEESDLEPSIPSESMLPRSGFPRALPAWARPDYNPPLVESWRRPDYQPPTVAGCALPP 248...260...270...280... 290.. 300...310...320...330...340 NS5A-D2 C338S NTYDVDMVDANLLMEGGVAQTEPESRVPVLDFLEPMAEEESDLEPSIPSECMLPRSGFPRALPAWARPDYNPPLVESWRRPDYQPPTVAGSALPP 248...260...270...280... 290.. 300...310...320...330...340 NS5A-D2 2CS

NTYDVDMVDANLLMEGGVAQTEPESRVPVLDFLEPMAEEESDLEPSIPSESMLPRSGFPRALPAWARPDYNPPLVESWRRPDYQPPTVAGSALPP

248...260...270...280... 290.. 300...310...320...330...340

NS5A-D2 2CS M254C

NTYDVDCVDANLLMEGGVAQTEPESRVPVLDFLEPMAEEESDLEPSIPSESMLPRSGFPRALPAWARPDYNPPLVESWRRPDYQPPTVAGSALPP

248...260...270...280... 290.. 300...310...320...330...340

NS5A-D2 C298S A311G

NTYDVDMVDANLLMEGGVAQTEPESRVPVLDFLEPMAEEESDLEPSIPSESMLPRSGFPRALPGWARPDYNPPLVESWRRPDYQPPTVAGCALPP

248...260...270...280... 290.. 300...310...320...330...340

NS5A-D2 2CS M254C A311G

NTYDVDCVDANLLMEGGVAQTEPESRVPVLDFLEPMAEEESDLEPSIPSESMLPRSGFPRALPGWARPDYNPPLVESWRRPDYQPPTVAGSALPP

248...260...270...280... 290.. 300...310...320...330...340

Mutations de résistance à des inhibiteurs de CypA

Mutations Proline-Alanine et A311G

Expression et purification des domaines recombinants NS5A-D2 2.1.1.3

JFH1 WT et mutants.

Les domaines recombinants D2 WT et mutants ont été produits chez la souche BL21(DE3) de E. Coli. Après transformation de ces bactéries par les vecteurs d’expression, une préculture de 20 ml est effectuée en milieu riche Luria-Bertani (LB) en présence d’ampicilline pendant une nuit afin d’obtenir une préculture à saturation. La préculture est ensuite centrifugée et le culot de bactéries est resuspendu dans un litre de culture en milieu minimum (M9) contenant une unique source d’azote marquée 15 N et/ou une unique source de glucosemarqué 13C. L’induction de la production de protéines à l’IPTG est réalisée lorsque la culture est en milieu de phase exponentielle de croissance, ce qui correspond à des conditions optimales pour la production de protéines par les bactéries. La bactérie synthétisant ses propres acides aminés à partir d’une unique source d’azote et de carbone, le marquage isotopique de la protéine sera proche de 100%. Les différentes étapes de production sont contrôlées par SDS-PAGE (Figure 64). Le domaine D2 recombinant est bien exprimé dans les cellules E. coli BL21(DE3) après induction à 400 μM d’IPTG pendant 4h30. L’analyse par SDS-PAGE des cellules surexprimant NS5A-D2 montre une expression importante d’une protéine migrant comme un témoin de masse moléculaire de 20 kDa, alors que la masse du domaine D2 est de 11600 Da. Cette masse moléculaire en apparence élevée sur SDS-PAGE s’explique par la présence de nombreux résidus de prolines au sein de ce domaine.

Après la lyse des bactéries, NS5A-D2 doit-être purifié. Ce domaine étant thermorésistant, les extraits solubles peuvent être chauffés. Cette première étape de purification permet de précipiter un grand nombre de protéines contaminantes et d’inactiver les protéases issues de E. Coli. NS5A- D2 WT et les différents mutants ont été exprimés avec une étiquette poly-histidine permettant de réaliser une purification d’affinité sur colonne chargée en nickel. Le niveau élevé d’expression associé à la première étape de purification par chauffage et aux conditions stringentes de lavage de la chromatographie d’affinité au nickel ont permis d’obtenir un bon rendement et des protéines de puretés élevées nécessaires à leur étude par RMN. L’analyse SDS-PAGE de la chromatographie d’affinité (Figure 64) montre que la majorité des protéines n’ayant pas d’affinité

de 20 mg par litre de culture en milieu M9. Le rendement peut augmenter jusqu’à 30 mg pour 1 litre de culture en milieu riche LB. Des résultats similaires ont été obtenus pour NS5A-D2 Con1, avec un rendement légèrement moins important.

Figure 64. Expression et purification de NS5A-D2 chez E. coli. Les protéines sont analysées par SDS-

PAGE à 15% et colorées au Bleu de Coomassie. A gauche, Expression de NS5A-D2 et purification par chauffage. Piste 1, cellules E. coli non induites; piste 2, cellules E. coli 4h30 après induction à l’IPTG ; piste 3, fraction soluble du lysat bactérien (27 000 g, 30 min); piste 4, fraction soluble après chauffage à 75°C. A droite, Purification de NS5A-D2 par chromatographie d’affinité sur colonne chargée en nickel. Piste 1, protéines non retenues par la colonne; piste 2, protéines lavées par 25 mM d’imidazole ; piste 3 à 9, protéines éluées par un gradient d’imidazole de 25 mM à 250 mM.

2.1.2 Clonage, expression et purification des peptides recombinants

de NS5A-D2 (JFH1) WT et mutants marqués

_N

_C

Le peptide du domaine D2 de NS5A (JFH1), pepD2-WT (JFH1), correspondant au site d’interaction avec la CypA a été cloné et produit avec le même système de production de peptide recombinant décrit précédemment pour le peptide pepD2(Con1) (partie 1.3 des résultats). Sur le peptide de 20 résidus, 4 diffèrent entre les deux souches JFH1 et Con1 (Figure 65). Les peptides D2 (JFH1) mutés en D316E et A311G ont également été produits avec la même méthode. Ces mutations ont été créées par mutagénèse dirigée sur le vecteur d’expression pET32a-trxA- pepD2(JFH1).

Figure 65. Alignement de séquences des peptides pepD2(Con1) et pepD2(JFH1) correspondant au site d’interaction avec la CypA. Les 5 résidus de prolines sont indiqués en rouge. Les numérotations

des résidus sont indiqués, ainsi que les résidus identiques (*) et les résidus différents (:) entre les deux souches. PM 116 66 45 35 25 18 1 2 3 4 _PM 116 66 45 35 25 18 1 2 3 4 5 6 7 8 9 kDa kDa

2.1.3 Expression et purification de la CypA

La CypA (18 kDa) a été clonée sous le contrôle du promoteur PT7lac dans le vecteur pET15b possédant un gène de résistance à l’ampicilline. Cette construction permet l’expression de la CypA possédant une étiquette poly-histidine en N-terminal clivable par la thrombine grâce à la présence du site de coupure LVPR/GS entre la CypA et l’étiquette 6xHis. Pour l’étude de la CypA par RMN nous n’avons pas clivé cette étiquette poly-histidine. Ce clonage a été réalisé précédemment dans notre laboratoire.

La CypA est très bien exprimée de façon soluble chez E Coli et purifiée en une seule étape par chromatographie d’affinité sur une colonne chargée en nickel. Pour l’étude nous avons produit de la CypA non marquée et de la CypA marquée 15N, les rendements sont respectivement de l’ordre de 100 mg et 40 mg pour 1 L de culture.

Figure 66. Expression et purification de la CypA 15N. A, Expression de la CypA chez E. coli. Piste 1,

cellules non induites ; Piste 2 cellules induites à l’IPTG (0.4 mM, 4h30 à 37°C). B, Purification de la CypA par chromatographie d’affinité sur colonne de nickel. Piste 1, protéines non retenues par la colonne; piste 2, protéines lavées par 25 mM d’imidazole ; piste 3 à 8, protéines éluées par un gradient d’imidazole de 25 mM à 250 mM.

2.2 Mise en évidence du motif structural au sein de NS5A-