Les protéines non structurales La protéine p

2.4.2.1

p7 est une petite protéine membranaire de 63 acides aminés constituée de deux segments transmembranaires connectés par une petite boucle cytoplasmique, tandis que les extrémités N- terminal et C-terminal sont orientées vers la lumière du RE (Carrère-Kremer et al., 2002). Il a été montré que cette protéine de la famille des viroporines s’oligomérise et possède une activité de canal cationique (Carrère-Kremer et al., 2002; Pavlović et al., 2003). Son rôle précis n’est pas connu avec certitude. Elle joue un rôle dans l’assemblage et la sécrétion des virions (Steinmann and Pietschmann, 2010), notamment par son interaction avec la protéine NS2 régulant ainsi la localisation de core (Boson et al., 2011; Jirasko et al., 2010; Ma et al., 2011). p7 semble aussi importante pour l’entrée du virus dans la cellule hôte (Sakai et al., 2003).

La protéine non-structurale NS2 2.4.2.2

NS2 est une protéase à cystéine associée à la membrane du RE (Lorenz et al., 2006). Le domaine N-terminal est constitué de plusieurs domaines transmembranaires (Jones et al., 2007) et le domaine C-terminal en association avec le domaine N-terminal de NS3 forme la protéase NS2-3. Cette enzyme NS2-3 catalyse le clivage entre ces deux protéines lors de la maturation de la polyprotéine (Lorenz et al., 2006). La structure cristallographique du domaine protéase NS2 montre qu’elle forme un dimère possédant deux sites actifs, contenant chacun des acides aminés provenant des deux monomères. NS2 n’est pas indispensable à la réplication de l’ARN, elle est impliquée dans l’assemblage des particules virales (Jones et al., 2007).

Le complexe NS3-4A 2.4.2.3

NS3-4A est un complexe non covalent entre NS3 et le cofacteur NS4A. La structure de ces protéines a été caractérisées (Yao et al., 1999; Raney et al., 2010; Morikawa et al., 2011). NS4A est ancrée en N-terminal à la membrane par une hélice alpha transmembranaire de 21 acides aminés. NS3 est une protéine hydrophile, composée d’un domaine sérine protéase en N-terminal et un domaine NTPase/hélicase en C-terminal. L’association du domaine sérine protéase de NS3 avec le cofacteur NS4A permet d’activer le domaine sérine protéase de NS3 permettant de cliver la polyprotéine aux sites NS4A/NS4B, NS4B/NS5A, NS5A/NS5B (Penin et al., 2004a). Le domaine C-terminal NTPase/hélicase de NS3 intervient dans la réplication de l’ARN viral. L’activité hélicase de NS3 servirait à séparer les brins d’ARN positifs et négatifs de l’ARN viral

lors de la réplication et à abolir les structures secondaires des ARN (IRES et régions X de l’extrémité 3’non codante) lors de la traduction des protéines virales et lors de la réplication pour permettre à l’ARN polymérase d’accéder aux structures très repliées de l’ARN. L’activité NTPase du domaine C-terminal de NS3 permet de fournir l’énergie nécessaire à l’activité hélicase en hydrolysant les NTP et dNTP (Penin et al., 2004a). En 2011, deux inhibiteurs anti- sérine protéase NS3-4A ont été approuvé pour traiter le génotype 1b du VHC, il s’agit du Bocéprévir et du Télaprévir (Doyle et al., 2013) .

La protéine non structurale NS4B 2.4.2.4

NS4B est une petite protéine hydrophobe transmembranaire localisée dans la membrane du RE. Cette protéine est relativement mal caractérisée mais des programmes de prédictions de topologie indiquent que NS4B contiendrait 4 domaines transmembranaires ainsi qu’un domaine N-terminal et un domaine C-terminal localisés coté cytosolique. La partie N-terminal à la particularité d’être transloquée du côté de la lumière du RE (Elazar et al., 2004; Gouttenoire et al., 2009a; Gouttenoire et al., 2009b). Sa fonction serait de modifier la membrane du RE pour former le réseau membranaire nécessaire à la réplication de l’ARN viral (paragraphe 2.6.3) (Egger et al., 2002). L’activité GTPase et ATPase de cette protéine sont également nécessaires à la réplication de l’ARN viral (Thompson et al., 2009).

NS5A 2.4.2.5

NS5A est une phosphoprotéine hydrophile, ancrée à la membrane, de 49 kDa, riche en prolines (approximativement 10 % des acides aminés de la séquence totale de NS5A sont des prolines), indispensable pour la réplication du génome du VHC et la formation de particules virales, dont le rôle reste à élucider. Aucune fonction enzymatique n’a été mise en évidence pour cette protéine. Sa fonction serait d’interagir avec l’ARN viral, des protéines virales et cellulaires pour assurer la réplication du VHC.

d’homodimère peut lier l’ARN (Hwang et al., 2010), la cavité de l’homodimère servirait de rail pour l’ARN. En 2009, Love et al., ont obtenu une nouvelle structure de l’homodimère NS5A-D1 adoptant une organisation différente de celle qui était déjà publiée par Tellinghuisen et al. Ces deux structures pourraient chacune être impliquées dans des rôles différents de NS5A, la réplication de l’ARN viral et la formation des particules virales. Le domaine 1 de NS5A est la cible du Daclatasvir, une molécule anti-VHC approuvée par l’agence américaine FDA (Food and Drug Administration) en juillet 2015. Récemment Lambert et al., (2014) ont obtenue une structure cristallographique du domaine 1 de NS5A (génotype 1a), révélant deux nouvelles formes dimérique de ce domaine.

Les domaines 2 et 3 de NS5A ont une variabilité de séquence beaucoup plus élevée par rapport au domaine 1 (Penin et al., 2004a; Tellinghuisen et al., 2004). Le domaine 2 de NS5A a été caractérisé par résonance magnétique nucléaire (RMN) pour la première fois en 2007 par Liang et al. Les domaines 2 et 3 ont ensuite été caractérisés par RMN dans notre laboratoire (Hanoulle et al., 2010; Hanoulle et al., 2009a). Il s’agit de domaines désordonnés, c’est-à-dire qu’ils ne possèdent pas de structure tridimensionnelle stable dans le temps. Il a été montré que ces domaines désordonnés ont des propensions intrinsèques à former des structures secondaires en hélices-alpha (Verdegem et al., 2011; Hanoulle et al., 2010; Feuerstein et al., 2012). NS5A-D2 (Con1) possède deux tendances hélicales dans les régions 250-267 et 299-305. NS5A-D3 (Con1) possède deux tendances hélicales en N- et C-terminal dans les régions 360-379 et 442-445. NS5A-D2 possède des résidus essentiels à la réplication du génome viral (Tellinghuisen et al., 2007). Ross-Thriepland et al., (2013) ont également montré que ce domaine est nécessaire à la réplication virale, mais non indispensable pour la formation et la libération de virions. Au contraire, NS5A-D3 n’est pas strictement nécessaire à la réplication de l’ARN viral mais est indispensable à l’assemblage des particules virales infectieuses (Appel et al., 2008) (Figure 11).

Figure 11. La protéine non structurale NS5A. Adapté de Moradpour and Penin, (2013).

A, Représentation schématique de NS5A. La numérotation correspond à la souche Con1 (génotype 1b). L’organisation en trois domaines proposée par Tellinghuisen et al., (2004) est indiquée. Les domaines D1- D2 et D2-D3 sont séparés par des séquences de faibles complexités (LCS) 1 et 2 respectivement. Les résidus de cystéines 39, 57, 59, et 80 permettent de fixer un atome de zinc. L’extrémité N-terminale en hélice alpha amphipathique permettant l’ancrage membranaire est représentée par une rectangle gris. Les résidus de sérines impliqués dans la forme hyperphosphorylée de NS5A sont indiqués (S225, S229, S232). Les résidus de sérine 222 (pour le génotype 1b) et sérine 349 (pour le génotype 1a) sont les sites de phosphorylation de la forme basale de NS5A. Les rectangles bleu sont deux exemples de délétion n’affectant pas la réplication de l’ARN viral (Blight et al., 2000; Appel et al., 2005). Les flèches 384 et 418 représentent les sites d’insertion de la protéine GFP (Moradpour et al., 2004a) permettant de suivre la localisation de NS5A et des complexes de réplication dans le système réplicon sous-génomique du VHC. Le domaine de transactivation avec la région contenant le site de putatif de localisation nucléaire (NLS) sont illustrés par des rectangles gris. B, Forme dimérique de NS5A adapté de Moradpour et al., (2007). L’hélice amphipathique en N-terminal modélisée est suivie de la structure du domaine 1 sous forme de dimère (Tellinghuisen et al., 2005), permettant la fixation d’un atome de zinc. Les domaines 2 et 3 désordonnés de NS5A sont représentés par des traits ayant une conformation aléatoire.

Sur gel SDS-PAGE, NS5A apparait sous une forme phosphorylée de 56 kDa et une forme hyperphosphorylée de 58 kDa. Les sites d’hyperphosphorylation de NS5A ont été localisés dans une région riche en sérine allant du résidu 221 à 240 (génotype 2a), localisée dans la séquence LCS1. Des analyses réalisées par spectrométrie de masse ont révélé des motifs de phosphorylation complexes dans cette séquence, obtenus par cascade de phosphorylations séquentielles (Ross-Thriepland and Harris, 2014). Des mutations adaptatives ont été identifiées dans la séquence LCS1, correspondant à la perte des sites de phosphorylation. De plus, l’absence de la forme hyperphosphorylée de NS5A due à la présence d’inhibiteurs de kinases (des inhibiteurs de type ATP-competitive 2,4,5-trisubstitued imidazole) améliore la réplication virale

D1 LCS 1 D2 LCS 2 D3 36 213 250 342 356 447   C57 C59 S229  384 418 C39 C80 S225 S232       Membrane anchor S222 235-282   237 276 ISDR S349 (gt 1a)   A B D1 D2 D3 membrane RE lumen RE NS5A

2010), la glycogène synthase kinase 3 (GSK3) et la mitogen-activated protein kinase (MAPK) (Huang et al., 2007b).

Il a été montré que la phosphorylation du domaine 3 de NS5A est essentielle à la formation des particules virales. La délétion du domaine 3 de NS5A perturbe la co-localisation des protéines NS5A et core au niveau des gouttelettes lipidiques et abolit la formation des particules virales (Appel et al., 2008). Il a été montré que la substitution des résidus de sérine par des alanines au sein de NS5A-D3 (résidus 2428, 2430 et 2433) perturbe la phosphorylation de NS5A. Ceci conduit à une diminution de l’interaction core-NS5A, essentielle à la formation des particules virales (Masaki et al., 2008).

NS5A pourrait jouer un rôle de régulateur de gènes de la cellule hôte. NS5A possède côté C- terminal, un site putatif de localisation nucléaire (NLS) suggérant que NS5A, sous forme tronquée dépourvue d’hélice-α N-terminal, pourrait être transloquée dans le noyau pour utiliser ses propriétés d’activateur de la transcription (Ide et al., 1996). NS5A possède deux régions acides (régions 170-211 et 247-300 pour le génotype 1b) suivies d’une région riche en prolines (région 309-335 génotype 1b) entre les deux séquences LCS. Ce type de séquence primaire est retrouvé chez de nombreux facteurs de transcriptions cellulaires et viraux (Ko, 1991). NS5A pourrait activer le promoteur de l’IL8, une interleukine connue pour réduire l’activité antivirale de l’interféron, (Polyak et al., 2001). NS5A-D2 et D3 ainsi que les séquences LCS possèdent des motifs ProXaaXaaPro, ces motifs sont connus pour être présents dans de nombreuses protéines de signalisation et pour se lier aux domaines SH3 (Src-Homology 3). Les domaines SH3 sont des domaines d’environs 60 acides aminés composés de 6 brins béta retrouvés dans de nombreuses familles de protéines (PI3 kinases, Ras GTPase-activating protein, Bin1…) ayant un rôle dans différentes voies de signalisation cellulaire tels que la transactivation de gènes. Une interaction directe entre NS5A-D2 (étendu aux séquences LCS) et le domaine SH3 de Bin1 (Bridging integrator protein 1) a effectivement été mise en évidence par RMN, cependant l’incidence de celle-ci dans la réplication du virus n’a pas été démontrée (Feuerstein et al., 2012). La régulation de gènes par NS5A permettrait d’activer l’expression des facteurs de la cellule hôte nécessaires à la réplication virale.

NS5A interagit avec de nombreuses protéines virales et protéines de la cellule hôte (Tellinghuisen and Rice, 2002; Polyak, 2003; de Chassey et al., 2008). Les différents profils de phosphorylation et la nature désordonnée des domaines 2 et 3 permettent à NS5A d’interagir avec de multiples partenaires, faisant de NS5A « une plateforme » des interactions protéiques. De nombreuses études ont montré que NS5A est impliquée dans la modulation de la réponse

immunitaire, l’apoptose, la croissance cellulaire et différentes voies de signalisations cellulaires (Macdonald, 2004).

NS5B 2.4.2.6

NS5B (68 kDa) est une ARN-dépendante ARN polymérase (RdRp). Elle assure la réplication de l’ARN viral.

 Structure

La structure d’NS5B a été déterminée par cristallographie aux rayons X en 1999 (Ago et al., 1999; Bressanelli et al., 1999; Lesburg et al., 1999). NS5B possède une hélice transmembranaire en C-terminal de 21 acides aminés qui lui permet de s’ancrer à la membrane du RE. Cet ancrage n’est pas nécessaire in vitro pour l’activité ARN polymérase de NS5B (Lohmann et al., 1997; Yamashita et al., 1998) mais obligatoire in vivo pour la réplication du virus en culture cellulaire (Moradpour et al., 2004b). La suppression de la séquence d’insertion membranaire augmente la solubilité et favorise la purification de l’enzyme, ainsi la majorité des études biochimiques et structurales utilisent la forme appelée NS5BΔ21. NS5B possède une structure tridimensionnelle caractéristique des polymérases dite « en main droite » (Figure 12) constituée de trois sous domaines appelés « doigts », « pouce » et « paume » ainsi qu’un motif G220D318D319 caractéristique du site catalytique des ARN polymérases dépendantes de l’ARN. La plupart des structures publiées ont une conformation dite fermée, les « doigts » et le « pouce » forment un tunnel replié sur la « paume » permettant d’amener l’ARN jusqu’à la « paume » correspondant au site actif de la polymérase (Bressanelli et al., 1999). Le domaine « pouce » correspond à la région C-terminale de l’enzyme et possède un β-hairpin spécifique de la famille du VHC (les Flaviviridae) (Lescar and Canard, 2009). Ce β-hairpin (résidus 443-454) localisé dans le domaine « pouce » dépasse vers le site actif de l’enzyme et serait important pour le positionnement de l’extrémité 3’ de l’ARN viral pour l’initiation correcte de la réplication. Dans le contexte de la polymérase apo, ce β-hairpin est positionné à l’endroit où l’ARN se fixe (Hong et al., 2001; Zhong et al., 2000). Le site catalytique G220D318D319 se trouve à la jonction entre les 3 domaines.

Figure 12. Structure de NS5B (JFH1). a, Structure fermée de NS5B (code pdb : 2XXD) (Schmitt et al.,

2011), les trois domaines bleu, rouge et verts sont respectivement les doigts, la paume et le pouce. b, Structure ouverte de NS5B, en présence d’ARN (code pdb : 4E76) (Mosley et al., 2012).

 Synthèse de l’ARN viral par NS5B

L’initiation de la synthèse de l’ARN viral par NS5B est une initiation de novo, c’est-à-dire amorce indépendante. NS5B interagit avec l’ARN matrice du virus, un nucléotide triphosphate initiateur (NTPi) et un second NTP (NTPi+1). Il y a formation d’un pont phosphodiester entre le NTPi et le NTPi+1. Lors de l’initiation NS5B possède une conformation fermée, qui stériquement ne peut pas contenir au sein de son site actif un double brin d’ARN. La plupart des structures de NS5B obtenues par cristallographie ont une conformation fermée de la polymérase. La structure de NS5B de la souche JFH1 possède une conformation plus fermée, ceci serait une des raisons permettant d’expliquer l’efficacité accrue de réplication de la souche JFH1(Schmitt et al., 2011). En 2012, Mosley et al., ont obtenu une structure de NS5B en conformation plus ouverte avec de nombreux changements conformationnels, permettant la fixation d’un petit ARN double brin. La protéine NS5B utilisée dans cette étude possède une délétion du β-hairpin (Figure 12 b). Cette conformation ouverte correspondrait à celle de l’étape d’élongation. La transition entre l’étape d’initiation (correspondant à la conformation fermée de NS5B) et l’étape d’élongation (correspondant à la conformation ouverte de NS5B) serait une étape clé et cinétiquement limitante. Récemment, Appleby et al., (2015)ont obtenu la structure cristallographique de NS5B en conformation ouverte, sans délétion du β-hairpin, en présence de la matrice d’ARN, de l’amorce dinucléotide et d’un nucléotide UDP (Figure 13). Cette conformation ouverte de NS5B correspond à l’étape précédent celle de l’élongation. La régulation d’ouverture/fermeture de cette enzyme par différents partenaires viraux et cellulaires tels que NS5A et la CypA reste à déterminer.

Figure 13. Structure de NS5B en conformation ouverte lors de l’étape précèdent celle de l’élongation (Appleby et al., 2015). La protéine est coloré en fonction des sous domaines (rose, les

doigts ; bleu, la paume ; vert, le pouce), avec le β-hairpin en jaune. L’ARN matrice 5’-UACC est en bleu, l’amorce dinucléotide 5’-pGG est en magenta, et le nucléotide UDP en vert.

2.5 Facteurs cellulaires nécessaires à la réplication du