Régulation des paramètres physiques

Les paramètres physiques contrôlés sont ceux permettant de maintenir un environnement favorable au développement des cellules. En effet, le développement cellulaire est soumis à un certain nombre de paramètres qui doivent être contrôlés. Pour cela, la plupart des procédés sont équipés d’un système appelé Set Point Control (SPC, Figure 1.13).

Figure 1.13 Représentation du système de régulation des paramètres : Set Point Control.

Celui-ci met en jeu un dispositif de gestion à distance contrôlé via un poste informatique. Ainsi, l’utilisateur peut actionner les différentes commandes permettant de réguler les paramètres suivis depuis le poste à distance. De plus, équipé d’une armoire de régulation, le système devient autonome, ce qui confère au poste informatique un rôle purement de supervision. De ce fait, les risques dus à une panne informatique sont exclus. Les différents paramètres continuent d’être contrôlés par l’armoire de régulation.

4.1.1 Contrôler la température

Un des premiers facteurs influençant la culture cellulaire est la température. En effet, de nombreuses études mettent en avant l’effet de ce paramètre sur différentes lignées cellulaires [17-19]. Il convient donc de contrôler et de réguler ce paramètre. Les technologies

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résistances (pont de Wheatstone) permettant de mesurer la température à travers des changements de résistivité. Dans l’industrie, nous retrouvons couramment les sondes de type Pt-100, caractérisant un thermomètre à résistance de platine possédant une résistance de 100 Ω à 0 °C (selon l’échelle internationale de température de 1990, EIT-90).

Pendant la culture, si la température mesurée s’écarte substantiellement de la température cible (quelques dixièmes de degrés Celsius), le régulateur introduira préférentiellement de l’eau de refroidissement ou de la vapeur dans l’enveloppe thermique du bioréacteur afin de diminuer ou augmenter la température du milieu (Figure 1.14).

4.1.2 Contrôler le pH

Un autre paramètre influençant la croissance cellulaire d’une culture est le pH [20-22]. Celui-ci est généralement mesuré via la différence de potentiel existante entre deux électrodes : une électrode de mesure et une électrode de référence. La sonde pH, contenant généralement les deux électrodes, est reliée à un pH-mètre indiquant le paramètre en temps réel. De plus, grâce au système de contrôle SPC, le pH est

régulé en continu afin de favoriser le développement cellulaire (Figure 1.15). Ainsi, si le milieu devient trop acide, le dispositif introduit une solution basique, telle que KOH ou NaOH. Si le pH est trop basique, du CO₂ gazeux ou une solution acide, généralement H₃PO₄, est alors injecté (à noter qu’HCl n’est pas utilisé car cet acide attaque l’inox, matériau utilisé pour fabriquer les bioréacteurs à gros volumes).

4.1.3 Fournir de l’oxygène

Paramètre également influent sur la culture de cellules [22,23], l’apport en oxygène est essentiel à la respiration cellulaire. L’injection d’oxygène sous forme gazeuse (O₂) dans le milieu s’effectue à l’aide d’un système de bullage (Figure 1.16). Cependant, la difficulté réside dans le contrôle et la solubilisation du dioxygène. En effet, à 30 °C et pression

atmosphérique, la solubilité du dioxygène dans l’eau est de 7,55 mg/L et dépend de la

Figure 1.14 Schéma du dispositif de contrôle de la température.

Figure 1.15 Schéma du dispositif de contrôle du pH.

Figure 1.16 Schéma du dispositif d'apport en oxygène (bullage).

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pression partielle du dioxygène (loi de Henry), de la température (loi empirique de Truesdale et Downing [24]) ainsi que de la présence ou non de soluté dans le milieu (sels, tensio-actifs, substances organiques). Cependant, il est difficile d’agir sur ces différents paramètres pour augmenter la solubilité du dioxygène dans l’eau sans pour autant dégrader la culture. En effet, en augmentant la pression en gaz dans le milieu, bien que les cellules soient généralement peu sensibles à ces variations, non seulement la solubilité du dioxygène augmente (loi de Henry), mais aussi celle du dioxyde de carbone. En ce qui concerne la température, celle-ci est régulée à un certain seuil et ne varie donc pas. La solubilité n’est donc pas augmentée via l’augmentation de la température [24]. Quant aux différents solutés qui peuvent être mis en solution, les produits organiques n’augmentent que faiblement la solubilité, les sels dissous baissent la solubilité mais sont importants pour la croissance cellulaire et les tensio-actifs créent de la mousse à la surface du milieu. Par conséquent, un autre moyen que l’augmentation de la solubilité du dioxygène est utilisé. Celui-ci met en jeu le coefficient volumique de transfert d’oxygène 𝑘_𝐿∙ 𝑎 (produit de la constante de transfert du dioxygène en phase liquide 𝑘_𝐿 et de la surface spécifique d’échange 𝑎) [25]. La constante de transfert étant par définition constante, c’est en augmentant la surface d’échange que le dioxygène se solubilisera plus rapidement, soit en augmentant l’agitation (cisaillement des bulles de gaz), soit en augmentant l’aération (plus de bulles), soit en changeant le design du bioréacteur (très peu appliqué dans l’industrie). La quantité d’oxygène dissous est ensuite mesurée à l’aide d’un capteur à oxygène dissout (DO pour Dissovled Oxygen), qui indiquera la pO₂ du milieu de culture cellulaire. Le niveau de dioxygène dans le milieu est stabilisé afin de conserver une croissance cellulaire correcte et optimale.

4.1.4 Assurer un mélange homogène Afin d’assurer l’homogénéité du milieu, un système d’agitation est monté sur les bioréacteurs de culture cellulaire. Nous pouvons retrouver des travaux comparatifs des systèmes d’agitation pour les cuves dès les années 1950 [26]. De nos jours, le système d’agitation le plus utilisé en fermentation repose sur la turbine à disque, aussi appelée turbine de Rushton [27], à 4 ou 6 pâles (Figure 1.17). Ainsi, équipé d’un moteur,

le système permet d’entraîner une agitation radiale, qui présente une force de cisaillement plus importante que l’agitation axiale, ce qui améliore la surface spécifique d’échange 𝑎 et favorise la solubilisation du dioxygène dans le milieu. Enfin, les systèmes actuels sont équipés de contre-pâles disposées autour du bioréacteur afin de casser l’effet vortex

Figure 1.17 Schéma du dispositif d'agitation radiale.

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engendré par l’agitation. Concernant les systèmes d’agitation utilisés en cultures de cellules animales, ce sont généralement des hélices marines qui sont employées, permettant d’assurer un mélange homogène tout en limitant le cisaillement des cellules en culture.

4.1.5 Contenir la mousse

Les cultures cellulaires produisent de la mousse à la surface du milieu qui peut engendrer un dépôt de biomasse sur les parois du bioréacteur. La régulation de cette mousse est généralement faite à l’aide d’un capteur de mousse relié à de l’anti-mousse : si le capteur détecte la présence de mousse, un agent démoussant (huile de silicone) est injecté dans le milieu, ce qui permet de contenir ou d’écraser la

mousse (Figure 1.18). D’autres systèmes existent mettant en jeu des briseurs de mousse présents directement à la surface du milieu, tels que des disques de mousse [28].

4.1.6 Maintenir l’environnement stérile

En plus des paramètres précédents à réguler, il est important de maintenir un environnement stérile afin d’éviter une quelconque contamination extérieure de la culture cellulaire. Plusieurs points sont à prendre en compte pour assurer cette stérilité. Le premier point porte sur la qualité des matériaux pour les parois des bioréacteurs. Pour les faibles volumes, le verre est privilégié car facile à nettoyer et peu adhérent. Pour les plus gros volumes, l’inox est préféré car plus résistant. Le deuxième point à assurer pour maintenir le maintien de la stérilité est la résistance du bioréacteur à la pression, croissante lors des phases de stérilisation. Le système doit être capable de supporter des pressions allant de 3 bar à 6 bar (pression épreuve) avant la première utilisation. Le troisième point à contrôler est d’assurer l’imperméabilité du système motorisé pour l’agitation, souvent à l’aide d’un système de garniture d’étanchéité composé de bagues autour de l’axe d’agitation. Enfin, le dernier point à gérer est le traitement de l’air qui vient dans le bioréacteur. Des filtres sont placés aux entrées et sorties d’air du système afin de capter les micro-organismes qui pourraient contaminer la culture. Il s’agit de filtres en profondeur à l’aide de bouchons de coton secs (l’eau risque de créer un film qui laisserait passer les micro-organismes) ou de filtres écran se présentant sous forme de parois microporeuses (diamètres des pores inférieurs à 0,1 µm). Les différents filtres ont ainsi pour objectif d’éviter de laisser entrer les différents micro-organismes dans le bioréacteur en cas de dépression, mais aussi d’éviter de laisser sortir les produits contenus dans le bioréacteur.

Figure 1.18 Schéma du dispositif anti-mousse.

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4.1.7 Autres capteurs

Aujourd’hui, d’autres capteurs sont installés sur les bioréacteurs afin d’avoir une vue d’ensemble de tous les paramètres suivis pour la régulation de la culture cellulaire. Ainsi, les bioréacteurs peuvent également être équipés de sondes CO₂ ou d’analyseurs de gaz, de chromatographes (gazeux ou liquide) en ligne, ou encore de capteurs indirects. À titre d’exemple, il existe des capteurs calculant le quotient respiratoire de la culture. Dans le cas d’une culture de levure (Saccharomyces cerevisiae) en mode fed-batch, un capteur indirect permet de suivre le quotient respiratoire (QR) des micro-organismes. Le paramètre QR est maintenu préférentiellement à 1. Au dessus de ce seuil, les cellules produisent de l’éthanol tandis qu’en dessous, la culture est en manque de glucose pour nourrir les cellules. Ainsi, en reliant ce capteur à l’armoire de régulation utilisée dans un système SPC, l’ajout de glucose dans la culture pourra être contrôlé en fonction des mesures du capteur mesurant le quotient respiratoire (Figure 1.13).