Modèles pour les concentrations en glutamate, lactate et ammonium

lactate et ammonium sont produites par les cellules. Les erreurs RMSEP des modèles obtenus sur la base des spectres Raman acquis à différents temps et des mesures de

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référence sont présentées Figure 3.10. Nous pouvons voir que pour le glutamate et l’ammonium, un RMSEP minimum est atteint pour des spectres de 5 min tandis que le modèle lactate ayant l’erreur la plus faible concerne les spectres acquis sur 16 min.

Le modèle glutamate, obtenu à partir de spectres de 10 × 30 s, est représenté Figure 3.12a. L’erreur RMSEP obtenue pour ce modèle (0,11 mM) est tout à fait satisfaisante par rapport à la gamme de concentration étudiée (0,95–2,55 mM). Toutefois, sur le graphique des concentrations prédites en fonction des concentrations mesurées, nous pouvons voir que le modèle présente certains écarts sur les références entre 1,5 mM et 1,7 mM. Néanmoins, l’étude des coefficients de régression permet de montrer que le modèle se repose sur des bandes spectrales caractéristiques de la molécule de glutamate. En effet, trois zones ressortent principalement sur ces coefficients, Figure 3.12a. D’une part, les bandes principales sont observées à 850 cm-1 et 1020 cm-1, tout comme elles l’avaient été pour le modèle glutamate de la lignée cellulaire CHO proposé Figure 3.8b. Ces bandes sont directement assignées aux élongations ν(C–C) de la chaine carbonée [137]. D’autre part, les bandes entre 1450–1350 cm-1 sont assignées aux élongations symétriques du groupement carboxylate ν(CO₂-) et aux déformations δ(CH₂) de la molécule de glutamate [137,140]. Enfin, autour de 1100 cm-1, les bandes de vibration sont attribuées aux élongations ν(C–N) du groupement amine de la molécule [140].

Pour ce qui est du modèle basé sur les références lactate, bien que les différences soient non-significatives, ce sont des spectres de 16 min qui proposent le modèle PLS présentant le RMSEP le plus faible, Figure 3.10. Cette valeur fait exception par rapport aux autres métabolites (pour ce type de cellule) basés sur des temps de 5 min. L’observation des coefficients de régression permet de montrer que ceux-ci caractérisent bien la molécule de lactate à première vue. En effet, la bande caractéristique du lactate à 850 cm-1, traduisant la présence des élongations symétriques ν(CO₂-) est très importante, chose que nous avions déjà observée pour le modèle lactate des cellules CHO (Figure 3.7b). Toutefois, nous pouvons voir que le modèle de régression se base également sur la région autour de 1000 cm-1. Ceci n’est pas anodin puisqu’il s’agit des élongations ν(C–C), certes présentes au sein de la molécule de lactate, mais caractérisant plutôt les molécules telles que glutamine ou glutamate pour leurs chaines carbonées plus longues.

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Figure 3.12 Représentations graphiques des modèles calculés lors de la détermination du temps d’acquisition pour les molécules a) de glutamate, b) de lactate et c) d’ammonium d’une culture de cellules HeLa. Les spectres des modèles glutamate et ammonium possèdent des temps d’acquisition de 10 × 30 s

tandis que les spectres du modèle lactate présenté sont acquis sur 32 × 30 s. Les points noirs représentent les échantillons de calibration, les triangles rouges les échantillons du jeu test.

De manière plus générale, nous pouvons voir que les coefficients de régression des modèles basés sur les molécules glutamate, lactate et ammonium sont très similaires. L’explication repose une nouvelle fois sur les tendances des métabolites durant toute la durée du bioprocédé. En effet, nous pouvons voir Figure 1.6 (page 32) et Figure 1.7 (page 33) que les évolutions de ces trois produits sont les mêmes. Nous nous retrouvons alors dans le même cas que le glucose et la glutamine, section précédente. Bien que les modèles présentent des performances satisfaisantes, ils ne reposent pas sur les variables

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caractéristiques de chacune des molécules. C’est notamment le cas du lactate et de l’ammonium ici.

Il n’est donc pas pertinent de prendre en compte les résultats obtenus pour les modèles de régression des molécules de lactate et d’ammonium pour l’optimisation du temps d’acquisition. D’après les évaluations des coefficients de régression des modèles calculés, ce sont les biomarqueurs glucose et glutamate qui présentent le plus de fiabilité.

2.3.3 Modèles pour les densités TCD et VCD

Les biomarqueurs TCD et VCD présentent tous deux une erreur RMSEP minimum pour des temps d’acquisition de 10 min (Figure 3.10) et satisfaisante compte tenu des gammes de densité mises en jeu (Tableau 3.2). Les deux modèles de régression basés sur les spectres de 10 min pour les références TCD et VCD sont représentés Figure 3.13.

Nous pouvons observer l’existence de 4 échantillons (3 étalons, 1 test) particuliers sur les graphiques des densités prédites en fonction des densités mesurées. Il s’agit en fait de mesures réalisées en fin d’amplification cellulaire, donc au moment où le seuil maximal de cellules est atteint dans le bioréacteur. L’absence de mesure entre ces échantillons et le reste de la gamme est due au calendrier. Ces échantillons présentent donc un fort levier comparé aux autres, mais sont néanmoins nécessaires dans la construction des modèles afin de capter la croissance exponentielle des densités cellulaires.

Figure 3.13 Représentations graphiques des modèles calculés lors de la détermination du temps d’acquisition pour les paramètres a) TCD et b) VCD d’une culture de cellules HeLa. Les spectres des deux

modèles possèdent des temps d’acquisition de 20 × 30 s. Les points noirs représentent les échantillons de calibration, les triangles rouges les échantillons du jeu test.

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En observant les coefficients de régression des modèles, nous pouvons remarquer encore une fois que ceux-ci sont similaires. En effet, les tendances des deux biomarqueurs sont sensiblement les mêmes durant le procédé. Dans un premier temps, durant la multiplication cellulaire, les deux tendances sont immanquablement liées. La différenciation entre les deux paramètres métaboliques intervient suite à la phase plateau durant la culture de cellules. Cependant, les cellules HeLa sont ici utilisées comme support pour la culture virale. De ce fait, la phase de croissance cellulaire est stoppée le plus rapidement possible une fois la phase plateau atteinte, avant la phase de sénescence. Nous n’avons donc presqu’aucune différence entre VCD et TCD. Lors de la phase de culture virale, bien que le virus intervienne, les cellules continuent de se multiplier de la même manière. Nous pouvions alors nous attendre à une différenciation entre les paramètres VCD et TCD, mais la méthode de référence ne doit pas parvenir à détecter les cellules lysées. C’est pourquoi, les deux paramètres métaboliques sont si semblables tout au long du bioprocédé, même pendant la phase de culture virale.

Les coefficients de régression de ces deux modèles permettent toutefois de montrer que nous suivons bien les paramètres mettant en jeu la physiologie des cellules HeLa. Tout d’abord, les coefficients les plus importants sont situés autour de 1100 cm-1, assignés aux élongations symétriques ν(PO₂-) des colonnes de macromolécules d’ADN [144]. Nous pouvons également souligner les coefficients de régression compris à 1000 cm-1, traduisant les élongations ν(C–C) du cycle benzénique de la molécule de phénylalanine, abondante dans les cellules [145]. Les bandes autour de 1400 cm-1 sont associées aux déformations δ(CH₂) de diverses molécules des cellules [145], tandis que les bandes autour de 1600 cm-1

reflètent les modes de vibrations des amides primaires présentes sur les liaisons peptidiques des acides aminés [145].

Finalement, en ce qui concerne la détermination du temps d’acquisition pour les cellules HeLa, nous nous retrouvons dans le même cas de figure que pour les cellules CHO, à savoir des temps de 5 min pour les métabolites et 10 min pour les densités cellulaires. Nous choisissons donc de travailler uniquement sur des temps d’acquisition de 5 min (10 × 30 s), ce qui permet d’une part de simplifier l’acquisition pour le suivi de culture HeLa (un seul et unique temps d’acquisition), et d’autre part de permettre à terme de fusionner les données provenant de différents types de cellules (HeLa et CHO) pour la construction d’un modèle global de prédiction.