Modèles pour les concentrations en glutamate, en lactate et en ammonium

Les paramètres biochimiques glutamate, lactate et ammonium sont des métabolites produits par les cultures de cellules HeLa. Toutefois, ces produits ne sont pas formés à concentrations égales durant le bioprocédé.

En effet, le glutamate est très peu présent durant les cultures. Nous pouvons voir Tableau 4.4 que la gamme de concentration n’évolue qu’entre 0,00–2,55 mM. Les signaux Raman caractéristiques de cette molécule seront donc peu intenses et les variations spectrales plus difficiles à percevoir. Ainsi, nous pouvons voir que la régression PLS parvient difficilement à corréler les concentrations mesurées à partir des méthodes de référence et les spectres Raman (coefficient de détermination R2 calculé à 0,766, Tableau 4.4). Ceci apparait de manière évidente sur le graphique des concentrations prédites en fonction des concentrations mesurées, Figure 4.12a. En effet, nous pouvons clairement observer le manque de corrélation qui existe entre les mesures de référence et les prédictions réalisées,

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ce qui induit une forte erreur de prédiction (RMSEP à 0,42 mM) par rapport à la gamme de concentration.

Figure 4.12 Représentations graphiques des modèles calculés à partir de jeux de données cumulant les échantillons de plusieurs cultures de cellules HeLa pour les concentrations a) en glutamate, b) en lactate et c) en ammonium. Les points noirs représentent les échantillons de calibration, les triangles rouges les

échantillons du jeu test.

Nous pouvons également noter la structure des coefficients de régression du modèle PLS calculé pour ces concentrations en glutamate. Ils présentent en effet un niveau de bruit très élevé, signifiant qu’il est difficile de ressortir les contributions spectrales dues au glutamate du bruit de fond spectral. En reprenant les spectres acquis en continu des différents lots test, et en y appliquant le modèle PLS calculé, nous obtenons une nouvelle

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fois les prédictions réalisées durant toute la durée du bioprocédé. Les prédictions réalisées pour la concentration en glutamate sont disponibles Figure 4.13. Sur ces représentations, nous observons l’influence du bruit présent au sein des coefficients de régression. En effet, les prédictions présentent des variations très importantes d’un échantillon à l’autre, traduisant bien l’instabilité du modèle de régression et la difficulté à prédire la concentration en glutamate dans le milieu.

À propos du niveau de lactate dans le milieu, les performances obtenues sont satisfaisantes compte-tenu de la gamme de concentration mise en jeu. En effet, l’erreur RMSEP est estimée à 0,22 g/L pour une gamme variant entre 0,00 g/L et 1,89 g/L. Néanmoins, nous pouvons voir que l’erreur RMSECV approche les 0,08 g/L, ce qui reste très inférieur à l’erreur RMSEP calculée. Ceci traduit un certain manque de robustesse du modèle de régression à l’égard des échantillons des cultures test. Nous pouvons observer cet effet sur le graphique des concentrations en lactate prédites par rapport aux concentrations mesurées à l’aide de la méthode de référence, Figure 4.12b.

Figure 4.13 Représentations des prédictions réalisées sur les spectres des cultures de cellules HeLa test acquis en continu (en bleu) pour les concentrations en glutamate. Les concentrations obtenues à partir des mesures de référence sur les prélèvements sont représentées par les triangles rouges. Les absences

de prédictions entre 76–142 h pour les cultures #1 et #2 et avant 56 h pour la culture #5 sont dues à des soucis techniques lors de l’acquisition Raman.

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Nous remarquons qu’une partie des échantillons test présentent un biais important. Il s’agit des concentrations comprises entre 0,5 g/L et 1 g/L qui correspondent finalement aux échantillons de la culture #2. Ceci apparait nettement sur les prédictions des concentrations en lactate réalisées sur les spectres acquis en continu pour cette culture, Figure 4.14. Nous pouvons voir que les prédictions sont systématiquement inférieures aux mesures de référence. Toutefois, nous notons que malgré ce biais, le modèle est tout-à-fait capable de suivre la tendance de la concentration en lactate tout au long de la culture #2. De plus, nous pouvons noter que les prédictions réalisées en continu pour les autres lots test parviennent très bien à suivre l’évolution particulière du paramètre métabolique lactate.

Figure 4.14 Représentations des prédictions réalisées sur les spectres des cultures de cellules HeLa test acquis en continu (en bleu) pour les concentrations en lactate. Les concentrations obtenues à partir des mesures de référence sur les prélèvements sont représentées par les triangles rouges. Les absences de

prédictions entre 76–142 h pour les cultures #1 et #2 et avant 56 h pour la culture #5 sont dues à des soucis techniques lors de l’acquisition Raman.

En reprenant les coefficients de régression du modèle PLS basé sur les concentrations en lactate, Figure 4.12b, deux bandes principales ressortent majoritairement. Tout d’abord, nous pouvons observer un signal important autour de 860 cm-1, caractéristique des élongations ν(C–CO₂-) du groupement carboxylate de la molécule, dont la bande Raman est très intense sur les spectres de lactate pur [138]. De plus, nous pouvons observer un second signal caractéristique de la molécule de lactate à travers les bandes autour de 1000 cm-1. Celles-ci traduisent la présence des élongations ν(C–C) ainsi que les élongations ν(C–CH )

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du groupement méthyle présent en bout de chaine carbonée [138]. Nous pouvons donc dire que les modèles de régression basés sur les références en lactate reposent sur des bandes spectrales caractéristiques de la molécule mise en jeu.

Figure 4.15 Représentations des prédictions réalisées sur les spectres des cultures de cellules HeLa test acquis en continu (en bleu) pour les concentrations en ammonium. Les concentrations obtenues à partir des mesures de référence sur les prélèvements sont représentées par les triangles rouges. Les absences

de prédictions entre 76–142 h pour les cultures #1 et #2 et avant 56 h pour la culture #5 sont dues à des soucis techniques lors de l’acquisition Raman.

En ce qui concerne l’ammonium, le modèle de régression développé présente des performances permettant de réaliser des prédictions satisfaisantes. En effet, l’erreur RMSEP (0,42 mM) reste faible compte-tenu de la gamme de concentration proposée (0,32–5,04 mM). Toutefois, nous pouvons encore noter les différences qui existent entre les erreurs RMSEP et RMSECV qui traduisent une nouvelle fois certaines erreurs lors des prédictions des échantillons des cultures test. En confrontant les représentations graphiques mettant en jeu les prédictions réalisées en continu sur les cultures test (Figure 4.15) et les concentrations prédites en fonction des concentrations mesurées (Figure 4.12c), nous pouvons remarquer que les erreurs de prédiction interviennent en majeure partie sur la fin de la phase de culture cellulaire (soit pour les plus fortes concentrations) et sur les phases de culture virale.

L’analyse des coefficients de régression est similaire à ce que nous avions obtenu lors de l’étude du temps d’acquisition optimal pour les spectres Raman (Chapitre 3, section 2.3.2,

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Modèles pour les concentrations en glutamate, lactate et ammonium, page 100). Les signaux présents sur la région 1000–900 cm-1 traduisent bien la présence de molécules d’ammonium en solution aqueuse [141]. Toutefois, ces travaux ne permettent pas d’attribuer la bande autour de 1450 cm-1 à la molécule d’ammonium. Mais en prenant les prédictions en continu des cultures test Figure 4.15, nous pouvons voir que les modèles permettent de suivre l’évolution du biomarqueur de manière adéquat pendant toute la durée de la culture, que ce soit durant la phase de culture de cellules ou pendant la culture virale. En somme, nous pouvons conclure quant aux modèles de régression construits pour réaliser le suivi des métabolites formés durant les cultures impliquant les cellules HeLa qu’ils permettent de déterminer convenablement les concentrations des produits formés, à condition de présenter suffisamment de variabilité dans les concentrations. En effet, le paramètre glutamate, faiblement produit par les cellules HeLa est difficilement modélisable.