Modèles pour les concentrations en glutamine, en glutamate et en ammonium . 135

Lors de l’étude des paramètres glutamine, glutamate et ammonium dans la partie 2.2.2 du Chapitre 3 (page 93), nous avions pu montrer que les modèles de régression basés sur les molécules de glutamine et glutamate étaient pertinents, tandis que le modèle de régression pour la prédiction des concentrations en ammonium ne s’appuyait pas sur les bandes caractéristiques de la molécule.

Figure 4.4 Représentations graphiques des modèles calculés à partir de jeux de données cumulant les échantillons de plusieurs cultures de cellules CHO pour a) la glutamine, b) le glutamate et c) l’ammonium.

Les points noirs représentent les échantillons de calibration, les triangles rouges les échantillons du jeu test.

Chapitre 4 Optimisation et recherche de robustesse pour les modèles de régression des biomarqueurs

Les modèles de régression obtenus en accumulant les données des huit lots de cellules CHO cultivées dans les conditions normales sont représentés Figure 4.4a pour les concentrations en glutamine, Figure 4.4b pour les concentrations en glutamate et Figure 4.4c pour les concentrations en ammonium. En reprenant les résultats obtenus pour chaque métabolite (Tableau 4.2) nous pouvons remarquer que, de manière générale, le nombre de variables latentes est plus important pour construire les modèles ici que pour l’étude du temps d’acquisition (Tableau 3.1, page 89), et ce pour les mêmes raisons que pour les modèles des concentrations en glucose et lactate : le fait d’avoir plus de données induit plus de variance à expliquer lors de la modélisation PLS.

En prenant d’abord le modèle calculé pour les concentrations en glutamine, nous pouvons voir que celui-ci présente une erreur RMSEP importante (0,46 mM) par rapport à l’erreur RMSECV calculée (0,17 mM). La Figure 4.4a permet de montrer que les prédictions réalisées pour les échantillons de la culture test présentent des écarts de plus en plus importants à mesure que la concentration en glutamine croit, ce qui engendre cette erreur RMSEP. Ceci provient directement de la gamme de concentrations obtenue à partir des mesures des prélèvements par la méthode de référence.

Pour la glutamine, les mesures sont arrêtées à partir de 240 h de culture (soit au bout de 10 j) pour la culture test, ce paramètre n’étant plus suivi à partir de ce moment (en routine). De ce fait les concentrations en glutamine présentent des gammes de variations faibles (0,00–2,72 mM) et donc difficilement perceptibles en spectroscopie Raman. Toutefois, les coefficients de régression permettent de mettre en avant des bandes caractéristiques similaires à ce que nous obtenions précédemment. Ainsi, les signaux obtenus à 1020 cm-1 et 850 cm-1 permettent de traduire les élongations ν(C–C) de la chaîne carbonée [139,140]. Nous pouvons également distinguer plusieurs bandes importantes entre 1500–1350 cm-1 représentant les groupements amide des molécules de glutamine (élongations ν(C–N) et déformations δ(N–H)) et les groupements carboxyle et les déformations δ(CH₂) de la chaîne carbonée [139,140]. Enfin, nous pouvons voir que les bandes dans la région 3000–2800 cm-1, traduisant les élongations ν(C–H) [146], présentent également des coefficients de régression importants. Malgré les observations réalisées sur les prédictions des échantillons de la culture test, nous pouvons considérer que le modèle obtenu est satisfaisant pour suivre la tendance du métabolite, les coefficients de régression étant cohérents.

Tout comme pour le glucose et le lactate, en prédisant les concentrations en glutamine à partir des 4380 spectres acquis en continu pour la culture test, nous pouvons obtenir l’évolution de la teneur en glutamine pendant toute la culture. Cette évolution, représentée

Chapitre 4

Optimisation et recherche de robustesse pour les modèles de régression des biomarqueurs

Figure 4.5a, permet de montrer que la tendance du paramètre glutamine est convenablement déterminée malgré les écarts croissants. En plus de montrer l’évolution du biomarqueur, le modèle de régression permet également de faire ressortir les feeds réalisés durant la culture qui impactent la concentration du métabolite (de manière moins importante que le glucose, il convient de noter). Nous devons ici noter que les feeds réalisés contiennent de la glutamine, raison pour laquelle nous observons des sauts de concentration lors du feeding.

Figure 4.5 Représentations des prédictions réalisées sur les spectres de la culture de cellules CHO test acquis en continu (en bleu) pour a) la glutamine, b) le glutamate et c) l’ammonium. Les concentrations de

référence sont représentées par les triangles rouges.

En ce qui concerne le modèle de régression pour les concentrations en glutamate, nous pouvons d’abord remarquer que l’erreur RMSEP (0,41 mM) est moins importante que l’erreur RMSECV (0,63 mM), Tableau 4.2. Ceci traduit simplement le fait que les variations entre les échantillons présents lors de la validation croisée sont plus importantes que les variations qui existent par rapport à l’ensemble test. Donc, puisque plus de variations sont prises en compte durant l’élaboration du modèle, les prédictions réalisées présentent moins d’erreur. Nous pouvons observer cela Figure 4.4b, où les écarts observés entre les concentrations prédites et les concentrations mesurées sont en moyennes plus importants pour les échantillons de calibration (points noirs) que pour les échantillons test (triangles rouges). L’analyse des coefficients de régression permet de montrer que ces derniers reposent principalement sur la bande à 400 cm-1 traduisant en partie les vibrations du squelette

Chapitre 4 Optimisation et recherche de robustesse pour les modèles de régression des biomarqueurs

carboné du glutamate [140]. La bande à 1020 cm-1 est également importante et traduit les élongations ν(C–C) de la chaîne carbonée. Enfin, la bande à 1350 cm-1 traduit les vibrations ν(CO₂-) du groupement carboxylate de la molécule. En prenant les prédictions réalisées sur les spectres acquis en continu durant toute la durée de la culture test (Figure 4.5b), nous pouvons voir que la tendance de la concentration en glutamate est respectée tout au long de la culture et permet également de mettre en avant la présence de feeds puisque ce paramètre, tout comme la glutamine, est impacté par ce phénomène (également de manière moins importante que le glucose, celui-ci étant bien plus concentré dans les feeds).

Pour finir, nous pouvons voir que les résultats obtenus pour les concentrations en ammonium présentent des erreurs RMSECV (0,85 mM) et RMSEP (0,99 mM) faibles compte tenu de la gamme d’étalonnage (0,30–9,70 mM). En prenant en compte le graphique des concentrations prédites en fonction des concentrations mesurées, Figure 4.5c, nous pouvons voir qu’il existe des écarts importants entre les prédictions et les mesures de référence. En réalité, en prenant en compte les coefficients de régression, nous pouvons une nouvelle fois voir que ces-derniers ne reposent pas sur les bandes caractéristiques de la molécule d’ammonium, tout comme nous avions pu le montrer lors du chapitre précédent (partie 2.2.2 du Chapitre 3, Modèles pour les niveaux en glutamine, glutamate et ammonium, page 93). Ainsi, le modèle de régression calculé pour la concentration en ammonium en prenant en compte les éléments des huit cultures présentes dans l’ensemble d’apprentissage ne permet pas de développer de modèle de régression cohérent. En prenant les prédictions réalisées sur les 4380 spectres acquis en continu, nous pouvons très bien voir que le profil obtenu pour les prédictions en ammonium ne suit pas de manière convenable l’évolution obtenue à l’aide de la méthode de référence. Il ne s’agit pas ici de simples écarts de prédiction permettant toutefois d’obtenir l’évolution du paramètre biochimique (tel que le modèle de régression pour les concentrations en glutamine par exemple) mais bel et bien d’un manque de corrélation entre les spectres et les mesures obtenus à l’aide de la méthode de référence. Nous pouvons également noter la répétabilité de prédiction moins importante lorsque des spectres consécutifs sont sollicités.

1.1.3 Modèles pour les densités TCD et VCD

Les modèles de régression basés sur la densité en cellules vivantes VCD et la densité totale en cellules TCD sont très similaires. Dans un premier temps, nous pouvons une nouvelle fois souligner le fait que nous utilisons plus de variables latentes pour construire les modèles de régression basés sur les densités cellulaires lors de l’accumulation d’échantillons provenant de plusieurs cultures de cellules (Tableau 4.2) que lors de l’étude du temps d’acquisition (Tableau 3.1, page 89). Nous pouvons ensuite remarquer que les

Chapitre 4

Optimisation et recherche de robustesse pour les modèles de régression des biomarqueurs

deux modèles de régression sont très similaires. En effet, les mesures de référence pour les densités TCD et VCD sont très proches, les valeurs obtenues pour ce dernier paramètre étant évidemment inférieures. Ceci joue également sur les coefficients de régression des deux modèles (Figure 4.6).

Nous pouvons voir que les profils obtenus présentent des allures très similaires. Le manque de différence entre les mesures de référence des deux densités ne permet pas de construire de modèle de régression bien distinct entre les paramètres VCD et TCD, ce qui apparait à travers les coefficients de régression similaires Figure 4.6 et les mesures de référence Figure 4.7. Néanmoins, les erreurs de prédiction RMSEP obtenues pour chaque paramètre biochimique (1,10·106 cell/mL pour la densité VCD et 1,13·106 cell/mL pour la densité TCD) soulignent des capacités prédictives satisfaisantes. Cependant, en prenant en compte indépendamment les prédictions réalisées sur les spectres acquis tout au long de la culture, Figure 4.7, nous pouvons voir que les modèles permettent de bien suivre les tendances de chacun des paramètres biochimiques pendant la culture. Nous pouvons également noter l’impact des feeds, notamment à partir du milieu de culture pour les deux paramètres. En effet, l’ajout de feed entraine une augmentation du volume total du contenu du bioréacteur et donc une diminution des densités en cellules, ce qui est observé sur les traces déterminées, Figure 4.7a pour le paramètre VCD et Figure 4.7b pour le paramètre TCD.

Figure 4.6 Représentations graphiques des modèles calculés à partir de jeux de données cumulant les échantillons de plusieurs cultures de cellules CHO pour a) la densité en cellules vivantes et b) la densité

totale en cellules. Les points noirs représentent les échantillons de calibration, les triangles rouges les échantillons du jeu test.

Chapitre 4 Optimisation et recherche de robustesse pour les modèles de régression des biomarqueurs

Pour conclure quant aux modèles de régression développés pour les cultures de cellules CHO, nous avons pu voir qu’en prenant en compte dans l’ensemble de calibration les échantillons provenant de plusieurs lots, nous pouvions réduire les variations qui existent entre les différents batches en intégrant celles-ci aux modèles de régression. En prenant en considération au sein du jeu test les échantillons d’une culture extérieure à l’ensemble d’apprentissage, nous pouvons alors éprouver les modèles de régression et présenter leurs capacités prédictives pour les différents biomarqueurs engagés. Rappelons que si nous prenons l’erreur calculée lors de la prédiction des densités VCD d’une culture de cellules CHO par un modèle de régression basé sur les échantillons d’une seule culture (résultats obtenus section 3.3 du Chapitre 3, Application du nouveau traitement de données spectrales, page 123), nous obtenions une erreur RMSEP à 1,54·106 cell/mL. En cumulant les échantillons de huit cultures, nous obtenons ici une erreur RMSEP de 1,10·106 cell/mL. D’après cette amélioration, nous pouvons en partie conclure que le fait d’accumuler les différentes cultures permet d’améliorer la robustesse du modèle de régression.

Figure 4.7 Représentations des prédictions réalisées sur les spectres de la culture de cellules CHO test acquis en continu (en bleu) pour a) la densité VCD et b) la densité TCD. Les densités obtenues à partir

des mesures de référence sur les prélèvements sont représentées par les triangles rouges.

Nous réalisons alors des travaux similaires pour les modélisations chimiométriques des paramètres biochimiques des cultures des autres types de cellules mis en jeu au cours de ces travaux de recherche, à savoir les cellules HeLa et les cellules Sf9.