Régulation de l’épissage alternatif

L’épissage alternatif n’est pas le fait du hasard. Des études ont démontré que les patrons d’épissage d’un même gène varient au cours du développement, selon le tissu ou l’activité cellulaire. De plus, les données montrent que l'expression des isoformes d'un même gène peut varier en réponse par exemple à une stimulation par des facteurs de croissance (cytokines, hormones) ou la stimulation antigénique du TCR des lymphocytes T (Matter, et al., 2000; Weg- Remers, et al., 2001). Ces données prouvent que l’épissage alternatif est un mécanisme hautement régulé et que les signaux extracellulaires influencent l’apparition de tel ou tel transcrit. Cette régulation fait intervenir des séquences exoniques ou introniques régulatrices agissant en "cis" et des facteurs protéiques liant ces séquences agissant en "trans".

III.1.3.1 Des sites d’épissage sous-optimaux et des éléments de

séquences régulatrices agissant en "cis"

Alors que les sites d'épissage forts utilisés constitutivement possèdent des séquences fortement similaires aux séquences consensus établies pour les sites 5' et 3' d'épissage, les sites d'épissage alternatifs ont souvent des séquences dégénérées par rapport aux séquences consensus. La force des sites 3' d'épissage dépend, en plus de la séquence du site 3' proprement dite, de la séquence polypyrimidine et de la séquence de branchement. Les sites 3' faibles ont souvent un enchaînement de pyrimidine entrecoupé de purines et/ou une séquence de branchement non canonique, parfois le nucléotide utilisé pour le branchement n'est même pas une adénosine. Ces caractéristiques rendent moins efficaces l'interaction des composants splicéosomaux avec les séquences aux jonctions exon-intron et intron-exon. Dans ce cas, l'assemblage des complexes splicéosomaux est guidé et facilité par des facteurs protéiques qui se fixent à des éléments régulateurs présents au niveau des exons et/ou des introns. Il existe deux types de séquences régulatrices: des séquences activatrices et inhibitrices. Les séquences exoniques ESE (Exonic Splicing Enhancer) sont les sites de liaison des protéines SR. Une fois fixées, celles-ci peuvent promouvoir la phase de définition de l'exon en recrutant la machinerie d'épissage par leur domaine RS. Les séquences introniques ISE (Intronic Splicing Enhancer) peuvent stimuler l'étape de définition de l'exon et activer des exons "faibles" ou cryptiques. A l'inverse, les séquences inhibitrices ESS (Exonic Splicing Silencer) et ISS (Intronic Splicing Silencer) inhibent la phase de définition de l'exon en recrutant des répresseurs de la famille des hnRNP aux sites d'épissage ou aux sites proximaux (Figure 25). D'une manière générale, la distribution des séquences

activatrices et inhibitrices varie en fonction des exons constitutifs, des exons alternatifs et des introns. En effet, dans les introns, on trouve une forte proportion de séquences inhibitrices tandis que dans les exons constitutifs on trouve une plus forte proportion de séquences activatrices. Par contre, dans les exons alternatifs, on trouve environ autant de séquences activatrices que de séquences inhibitrices (Blencowe, 2006).

Figure 25 : Régulation de l'épissage alternatif par des éléments de séquences régulatrices.

L'épissage alternatif est régulé par l'existence au niveau du pré-ARNm de séquences régulatrices qui fixent des constituants du splicéosome. Ces séquences sont définies sur la base de leur localisation et leur activité comme ESEs et ESSs (Exonic Splicing Enhancer ou Silencer), et ISEs et ISSs (Intronic Splicing Enhancer ou Silencer). Les ESE ou ISE fixent des protéines de la famille SR qui vont activer les sites d’épissage les plus proches ou inhiber les ESS ou ISS, tandis que les ESS ou ISS répriment les sites d’épissage ou les séquences activatrices en fixant les protéines de la famille hnRNP. Le choix des exons alternatifs dépend de la balance entre ces éléments régulateurs sur le pré-ARNm et du ratio des protéines régulatrices interagissant avec eux.

D’après Blencowe, 2006.

III.1.3.2 Facteurs protéiques impliqués dans l'épissage et agissant en

"trans"

Deux grandes familles protéiques jouent un rôle crucial dans la régulation de l'épissage et le choix des exons à épisser. Ce sont les protéines de la famille SR (Serine-Rich Arginine) et les protéines de la famille hnRNP (Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein). Ces protéines influencent toutes de façon dépendante de leur concentration et/ou de leur activation, l'assemblage du splicéosome aux sites d'épissage, en interagissant avec d'autres facteurs d'épissage et/ou les séquences régulatrices présentes au niveau du pré-ARNm.

La famille des protéines hnRNP comprend plus de 25 protéines, découvertes d’abord dans des cellules HeLa, et nommées hnRNP A-U (Beyer, et al., 1977; Dreyfuss, et al., 1993). Dans cette famille, les protéines les plus représentées sont hnRNP A1, A2, B1, B2, C1 et C2. Elles sont très abondantes dans la cellule, jusqu’à 100 millions de copies par cellule (Dreyfuss, et al., 2002). Ces protéines contiennent un ou plusieurs domaines de fixation à l’ARN appelés domaines RRM (RNA Recognition Motif) ainsi que des domaines dits auxiliaires. Elles se lient à l’ARN, soit de manière peu spécifique, soit de manière séquence spécifique. Au sein du noyau, les protéines

hnRNP sont majoritairement localisées dans le nucléoplasme. Certaines sont capables de faire la navette entre le noyau et le cytoplasme, comme c’est le cas de la protéine hnRNP A1 (Pinol-Roma and Dreyfuss, 1992). Dès leur transcription, les ARN produits par l'ARN polymérase II sont associés avec un grand nombre de protéines hnRNP. Les protéines hnRNP sont donc présentes sur chaque transcrit de gène codant une protéine et peuvent intervenir indirectement sur la maturation des transcrits. Elles peuvent aussi agir de manière spécifique sur la régulation de l’épissage alternatif d’un pré-ARNm en se fixant avec une plus grande affinité sur les séquences régulatrices ESS et en réprimant l’épissage. La protéine hnRNP A1 est un régulateur négatif de l'utilisation des sites d'épissage, aussi bien 5' que 3' (Pozzoli and Sironi, 2005). Au niveau du site 5' d'épissage, de nombreuses recherches ont montré que la protéine hnRNP A1 est un antagoniste des activités des protéines SR (Caceres, et al., 1994; Mayeda, et al., 1993; Mayeda and Krainer, 1992; Yang, et al., 1994). La protéine hnRNP A1 est aussi capable de se fixer sur des séquences inhibitrices exoniques (ESS) et de réprimer l'utilisation du site 3' en amont, en empêchant l'assemblage des complexes splicéosomaux autour de ce site d'épissage (Caputi, et al., 1999; Del Gatto-Konczak, et al., 1999; Marchand, et al., 2002).

A côté de la famille des protéines hnRNP, la famille des protéines SR joue un rôle crucial dès les étapes précoces de l'assemblage des complexes splicéosomaux. Ces proéines se caractérisent par un ou deux domaines de fixation à l'ARN, de type RRM, et un domaine RS riche en résidus sérine et arginine. Les protéines SR sont essentielles à la définition des exons chez les eucaryotes supérieurs (Graveley, 2000). Elles sont aussi bien impliquées dans l'épissage constitutif que dans les régulations de l'épissage alternatif. Nous reviendrons dans un prochain chapitre sur cette famille de régulateurs cruciaux de l'épissage. D’autres protéines que les protéines SR présentent des domaines RS avec parfois des domaines RRM. Elles ont été classées dans la famille SRrp (SR related protein) également nommées protéines SR-like (Graveley, 2000). Certaines de ces protéines sont des facteurs d’épissage comme U2AF35 et U2AF65, d’autres sont des protéines de particules UsnRNP (U1-70K, U5-100K et (U4/U6.U5]-27K), d’autres enfin sont des protéines régulatrices de l’épissage (hTra2α et hTra2β) ou des protéines co-activatrices (SRm160 et SRm300). On trouve également dans cette famille des ARN hélicases (HPrp16, HRH1) et de manière intéressante, une famille de protéines kinases responsables de la phosphorylation du domaine RS des protéines SR (Clk/Sty 1, 2, 3).