Les protéines sériques et les traitements thermiques : effet sur le gel

1.3.3.1 La dénaturation des protéines sériques et ses actions dans le mélange laitier

La fabrication du yogourt passe par la standardisation du lait à fermenter. Comme vu précédemment, le lait subit ensuite divers traitements tels que la pasteurisation et l’homogénéisation. Les traitements thermiques (≥ 70 °C) ou à hautes pressions (≥100 Bar) peuvent sont source de dénaturation pour les protéines sériques (WP) favorisant des interactions avec les micelles de caséines. Ce phénomène a une implication importante sur la qualité finale des yogourts et beaucoup d’autres produits laitiers gélifiés.

Les αs2 et β-CN, à l’intérieure de la micelle, qui possèdent des résidus –SH potentiellement réactifs, sont très stables à des traitements dénaturants comme les traitements thermiques et les hautes pressions (Dalgleish et Corredig 2012). Les WP et les κ-CN sont, quant à elles, les premières touchées par ces traitements (Vasbinder, Alting et coll. 2003; Vasbinder et de Kruif 2003; Anema 2007; Considine, Patel et coll. 2007; Jovanic, Barac et coll. 2007; Edwards, Creamer et coll. 2008; Patel, Creamer et coll. 2008; Donato et Guyomarc'h 2009). La dénaturation engendre déploiement de ces protéines, exposant leurs acides aminés possédant un radical S-H. Le potentiel oxydoréducteur du lait étant favorable dans ces conditions, les WP seront alors capables de former des ponts disulfures intra et inter moléculaires résultant en la dénaturation irréversible des protéines et à leur polymérisation (Patel, Creamer et coll. 2008). Pour cette raison, la dénaturation des WP et la modification de la matrice laitière après les traitements thermiques ou de pression ont été intensivement étudiées. Il ressort de ces études une grande quantité d’information : le type de dénaturation provoqué, la nature des agrégats formés, les mécanismes de dénaturation, leurs cinétiques, indiquant comment contrôler ces phénomènes. La dénaturation des WP peut être plus ou moins réversible et provoque la formation d’agrégats en interagissant entre elles (agrégats WP-WP solubles) ou avec les κ-CN à la surface de la micelle.

La β-lg et l’α-lac sont les protéines les plus abondantes du sérum et sont impliquées dans la plupart des structures issues de cette dénaturation. Leurs cinétiques de dénaturation ont donc été les plus étudiées. La dénaturation de la β-lg, est décrite en plusieurs étapes successives. Premièrement, une série de changements de conformations réversibles dont on a observé les formes intermédiaires sont stabilisées par les molécules d’eau. Ensuite, un remaniement irréversible des ponts disulfures intramoléculaires mène au dépliement de la protéine et à l’exposition d’un résidu cystéine réactif. On peut alors distinguer trois formes de β-lg : native ; dénaturée de façon réversible et dénaturée irréversiblement (Anema 2008). Lorsque la β-lg est dénaturée de façon irréversible, elle peut se polymériser en se liant de façon covalente à d’autres protéines ayant des groupes sulfhydriles et catalyser la polymérisation par des liens disulfures (Considine, Patel et coll. 2007; Anema 2008). Selon Roefs et Kruif (1994), la polymérisation de la β-lg se divise en trois étapes comparables à la polymérisation radicalaire : initiation (Équation 1.1), propagation (Équation 1.2), et terminaison (Équation 1.3).

17 " ↔ "_! ↔ "_" ↔ ⋯ ↔ "_#$%&'()⇒ "∗

Équation 1.1 : Initiation de la polymérisation.

β= β-lg native

β*=β-lg dénaturée irréversiblement et réactive

k1 = constante de réaction

"_#$%&'+ "_$∗ (+⇒ "_$,)∗ Équation 1.2 : Propagation. _{k2 = constante de réaction}

i= nombre d’unités polymérisées; i ≥1

"_$,)∗ _{+ "}

-∗ (.⇒ "$,-,)

Équation 1.3 : Terminaison.

k3 = constante de réaction

j= nombre d’unités polymérisées – j ≥1

Tiré de Roefs et Kruif (1994)

Il existe donc 4 états pour les protéines sériques : natif, dénaturé réversible, dénaturé irréversible et polymérisé. Les polymères peuvent être des homopolymères de β-lg, ou des hétéropolymères pouvant impliquer d’autres protéines sériques, la κ-CN et parfois même l’αS2-CN grâce à leur résidu cystéine libre. La vitesse de formation des agrégats influence leur composition, leur taille et leur nombre (Vasbinder, Alting et coll. 2003; Hinrichs et Rademacher 2005; Edwards, Creamer et coll. 2008). La cinétique de polymérisation dépend elle-même des protéines en présence, de leurs ratios, de leurs quantités, des conditions environnementales du lait (pH, température, [Ca2+_{] …), de la teneur en solide et en sel dans le milieu, ainsi que de la température et de la durée} d’application du traitement thermique (Noh, Richardson et coll. 1989; Beaulieu, Pouliot et coll. 1999; Anema 2008). Maitriser cette cinétique revient à maitriser le type d’agrégats formés dans le lait.

Chaque protéine possède des zones de sensibilité aux températures et pressions différentes (Tableau 1.2). Cependant, quand elles sont en mélange, leur thermosensibilité est modifiée. Par exemple, l’α-lac possède une température de dénaturation plus basse que celle de la β-lg, mais sa dénaturation reste réversible jusqu’à 100 °C. En effet, la présence de quatre ponts disulfures localisés à l’intérieur de la structure globulaire, la chélation de calcium et l’absence de résidu -SH libre compliquent la polymérisation de l’α-lac en augmentant sa thermorésistance (Hinrichs et Rademacher 2005; Edwards, Creamer et coll. 2008; Patel, Creamer et coll. 2008). Quand elle est seule en solution en dessous de 100°C, elle ne polymérise donc pas. En revanche, en présence de BSA ou de β-lg, après un traitement thermique autour de 70°C, des agrégats d’α-lac sont observables. L’instabilité de ces deux protéines provoque les conditions oxydantes nécessaires à l’agrégation de l’α-lac (Considine, Patel et coll. 2007). La BSA est un très bon catalyseur, elle est capable d’abaisser la température de polymérisation de la β-lg qui est la plus thermorésistante des protéines sériques (Considine, Patel et coll. 2007). Il est également possible de moduler les cinétiques de réaction en modifiant les teneurs en minéraux et en extraits secs. Par exemple, l’ajout d’un ligant hydrophobe à la β-lg augmente sa thermorésistance (Anema 2008). L’ajout de calcium fait de même pour l’α-lac mais augmente la vitesse d’homopolymérisation de la β-lg et la taille des agrégats résultants (Hoffmann, Roefs et coll. 1996). Il est possible de ralentir la cinétique globale de dénaturation de toutes les protéines sériques par l’ajout de solides non protéiques, tel que du lactose. Celui-

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ci diminue l’hydratation protéique et notamment l’hydratation des formes dénaturées réversibles ralentissant l’étape d’initiation de la polymérisation des protéines (équation 1.1) (Anema 2008). Le pH influence aussi la dénaturation des protéines. Lorsque le pH augmente, le groupe thiol devient plus réactif conduisant à la formation d’une grande quantité de petits agrégats (Vasbinder et de Kruif 2003).

Tableau 1.2 : Température et pression de dénaturation des principales WP. Protéines

sériques Température de dénaturation seule en solution Pression de dénaturation Action en mélange

α-lac 35 °C si [Ca

2+_{] < 1 mol/mol d’α-lac} ≈66 °C sinon la dénaturation sera

réversible >400 MPa

<100 °C

Ne polymérise pas toute seule

β-lg 65 °C dénaturation réversible _{68 °C début d’agrégation 300-400 MPa (polymérisation)} 100-200 MPa (initiation) Catalyse l’agrégation des autres protéines ayant un résidu -SH

BSA 40 °C >400 MPa Catalyse l’agrégation des _{autres protéines soufrées}

Adapté de Considine, Patel et coll. (2007).

Les CN sont thermorésistantes, car leur structure est désordonnée et leur organisation en micelles les protège de la dénaturation par la chaleur. Par contre, la micelle subit tout de même des modifications lorsque le lait est chauffé ou homogénéisé. L’augmentation de température provoque une perte de solubilité du CO2 qui alcalinise le milieu. Le pH augmentant, les équilibres minéraux sont déplacés et la charge négative globale des CN augmente. Par exemple, à 100 °C, les CCP se solubilisent puis le calcium précipite (Lucey et Horne 2009; Dalgleish et Corredig 2012). L’augmentation des répulsions électrostatiques provoque la libération des α- et κ- CN (Anema 2007). L’équilibre entre interactions hydrophobes et ioniques est également modifié. En effet, le renforcement des interactions hydrophobes par la chaleur permet de maintenir la structure de base de la micelle malgré une perte de CCP.

Une montée en température et de pression permet également la polymérisation des CN soufrées (αS2- et κ-CN), soit entre elles ou avec d’autres agrégats de WP (Donato et Guyomarc'h 2009). À une pression atmosphérique et une température ambiante, la structure de la micelle ne permet pas aux WP d’atteindre les αS2-CN. Les hautes pressions « écrasent » la structure micellaire suffisamment longtemps pour exposer les résidus soufrés des αS2- CN, et l’augmentation de la température provoque la libération de CN possédant un résidu -SH. Les WP dénaturées réactives peuvent donc polymériser avec les αS2-CN. Cependant, le plus important reste l’agrégation des WP avec les κ-CN durant le traitement thermique. Grâce à cette interaction, les micelles de caséine peuvent être recouvertes d’agrégats de protéines sériques. Ce phénomène est mesurable par diffusion dynamique de la

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lumière indiquant le changement de taille micellaire (Schorsch, Wilkins et coll. 2001; Anema 2008; Lamb, Payne et coll. 2013).

Les principales réactions d’agrégation lors du chauffage du lait se réalisent entre la κ-CN, la β-lg et l’α-lac. Il peut donc y avoir plusieurs formes d’agrégats créés selon les traitements thermiques appliqués et les choix de standardisation effectués: des agrégats composés uniquement de WP ; des agrégats entre WP et κ-CN en solution ([WP/κ-CN]aq) ; et des agrégats de WP attachés à une micelle de CN via une κ-CN ([WP/κ- CN]micellaire) (Figure 1.9).

Figure 1.9 : Agrégats de protéines sériques attachés à la micelle ou dans le sérum vu par microscopie à balayage électronique (1) et par microscopie électronique à transmission (2).

Tirée de Donato et Guyomarc'h (2009).

Le type, la taille et le nombre de ces agrégats auront un impact déterminant sur la qualité du yogourt. Selon Donato et Guyomarc'h (2009), des questions restent en suspens quant à la formation des agrégats [WP/κ-CN]aq : (1) doit-il y avoir forcément la formation d’un complexe de WP avant qu’il ne s’associe à une κ- CN ? ; (2) les agrégats [WP/κ-CN]aq du sérum se polymérisent-ils sur la micelle puis se décrochent, ou alors la polymérisation a-t-elle lieu dans le sérum directement ? Des facteurs influençant la formation des agrégats [WP/κ-CN]aq ont été identifiés tels que le pH et le ratio CN:WP. De façon surprenante la température n’en fait pas partie (Vasbinder, Alting et coll. 2003; Vasbinder et de Kruif 2003; Donato et Guyomarc'h 2009).

Lorsque le pH est modifié de 6,2 à 7,1, les profils d’agrégation sont radicalement différents. En effet, Vasbinder et de Kruif (2003) et Anema (2007) ont construit un modèle représentant le profil d’agrégation obtenu en modifiant le pH avant traitement thermique (fig.1.10). Lorsque le pH augmente, la charge négative globale des CN augmente provoquant des répulsions électriques menant à la dissociation des κ-CN avec le reste des micelles. Les agrégats [WP/κ-CN] micellaires sont donc défavorisés. De gros agrégats se forment alors dans le sérum. Autour de pH 6,5, entre 85 % et 100 % des WP dénaturées sont associées à la micelle de caséines

Agrégats de WP dans le sérum Agrégats de WP sur les micelles de CN via les κ-CN

WP = Protéines Sériques CN = Caséines

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(Vasbinder, Rollema et coll. 2003; Vasbinder, Alting et coll. 2003; Vasbinder et de Kruif 2003; Anema 2007; Donato et Guyomarc'h 2009). Par exemple, Vasbinder et de Kruif (2003) décrivent une répartition homogène de petits agrégats [WP/κ-CN] autour de la caséine. En dessous de pH 6,5, les agrégats ne sont plus homogènes et augmentent de taille autour des micelles (Figure 1.10). Cette notion est importante car le lait cru peut avoir commencé à s'acidifier légèrement durant un entreposage prolongé.

Figure 1.10 : Modèle d'agrégation des WP dénaturées autour de la micelle de CN lors de traitements à haute température - temps courts en fonction du pH.

WP dénaturées= ; micelle de CN= ; tirée de Vasbinder et de Kruif (2003).

Le rôle des sels minéraux et de la force ionique sur la formation des agrégats [WP/κ-CN] micellaires est encore controversé, les interactions électrostatiques sembleraient ne pas être impliquées dans le contrôle de la formation des agrégats sur la micelle (Donato et Guyomarc'h 2009). Pour des conditions physicochimiques données, Kanning (2014) et Beaulieu, Pouliot et coll. (1999) ont montré que l’augmentation de la quantité de WP, dans le lait au départ, augmente l’association des WP dénaturées avec la micelle lors de l’étape de pasteurisation jusqu’au ratio CN:WP à 3:1. En dessous de ce ratio, les sites d’interactions autour de la micelle sont saturés et l’on commence à augmenter la quantité d’agrégats solubles (Figure 1.11). Il y aurait donc, pour des conditions de pH avant pasteurisation, une quantité maximale de protéines sériques qui peut interagir avec la micelle. Le temps et la température de pasteurisation détermineront ensuite l’expression de ce potentiel ou non.

Le contrôle de ces agrégats est très important dans la production de yogourt, car c’est une clef dans la maitrise de la rétention d’eau, de la densité et de la texture lisse du gel.

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Figure 1.11 : Répartition des agrégats de WP autour des micelles de caséines selon le ratio CN:WP. = micelle de caséines, = agrégat de WP formé sur la micelle, = agrégat de WP aqueux. Adaptée

de Kanning (2014) et Beaulieu, Pouliot et coll. (1999).

1.3.3.2 Modification du gel par les protéines sériques dénaturées

Les WP dénaturées peuvent être réparties de deux façons : soit en agrégats liés à la micelle, soit en agrégats solubles dans le sérum. Pendant l’acidification du lait, ces agrégats de WP s’associeront limitant la mobilité des caséines (Figure 1.12). Ce réseau sera d’autant plus développé qu’il y aura de WP dénaturées en solution. En revanche, les WP natives ne participent pas à la formation du gel (Schorsch et coll. 2001). La dénaturation des WP, suivant la pasteurisation permet une gélification à pH plus élevé que dans le cas d’un lait exempt de WP dénaturées et est à l’origine d’un gel final plus ferme et plus dense (Lucey 2002; Remeuf, Mohammed et coll. 2003; Sodini, Remeuf et coll. 2004; Damin, Alcântara et coll. 2009). Plus récemment, Andoyo, Guyomarc’h et coll. (2014); Andoyo, Guyomarc’h et coll. (2015) ont démontré que, malgré l’existence de ce réseau secondaire, la gélification du lait reste orchestrée par les interactions entre les caséines tant que le ratio CN:WP du lait reste égal ou supérieur à 4:1. En dessous, le réseau secondaire de WP dénaturées prend progressivement le contrôle des structures obtenues. Dans des solutions à 2 % de WP dénaturées, Alting et coll. (2000) ont démontré que les agrégats de WP étaient capables de former de nouveaux ponts disulfures entre eux durant une gélification acide à la température de la pièce. D’après leur étude, l’acidification commence par la formation du réseau de protéines via des interactions non covalentes entre les agrégats. Progressivement, la proximité des agrégats favorise la formation de liens covalents entre les résidus -SH disponibles. Cela contribue à augmenter fortement la fermeté de ces gels. Cependant, la formation de ponts disulfures dans le yogourt ou autre lait fermenté (à pH acide) durant l’entreposage à basse température n’a pas été démontrée (Weidendorfer et coll.; 2008). Récemment Krzeminski et coll. (2011) et Cheng et coll. (2017) ont émis l’hypothèse que ce genre d’interactions pourraient être impliquées pour des yogourts enrichis en WP, mais ce fait n’a pas été démontré expérimentalement.

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Figure 1.12 : Formation du réseau secondaire de WP dénaturées entre les micelles de caséine. = micelle de caséines, = agrégat de WP formé sur la micelle, = agrégat de WP aqueux

dispersé. Adaptée de Kanning (2014).

L’ajustement du ratio CN:WP avant pasteurisation est très important, mais également très délicat, en particulier pour les yogourts sans gras. Il existe un ratio CN:WP optimum qui dépend des conditions de pasteurisation définies. En-dessous de ce ratio, les agrégats de protéines sériques sont en surplus et produisent une structure grumeleuse (Lucey 2002). Au-dessus de ce ratio, le gel est très faible et perd beaucoup d’eau (Lucey et Singh 1998; Sodini, Remeuf et coll. 2004). Le but est de répartir les WP dénaturées entre les agrégats «enrobant » les micelles de caséines et les agrégats solubles du sérum (Andoyo, Guyomarc'h et coll. 2014; Andoyo, Guyomarc'h et coll. 2015). L’expansion du réseau protéique influence les caractéristiques rhéologiques du gel telles que l’élasticité, la consistance, la viscosité et la force nécessaire à la rupture du gel (Puvanenthiran, Williams et coll. 2002). Afin de favoriser ce réseau, il est nécessaire d’augmenter le nombre d’agrégats de WP solubles (Kanning 2014), donc de passer en dessous d’un ratio CN:WP de 3:1. Lorsque ce ratio est diminué (environ < 2,5:1), il y a apparition, durant le traitement thermique, de « super » agrégats (=agrégats composés d’agrégats) : ce sont des structures complexes, ne regroupant pas seulement des agrégats de WP autour des micelles, mais correspondant à plusieurs micelles rattachées entre elles par une succession d’agrégats de WP. Puvanenthiran, Williams et coll. (2002) ont comparé des yogourts fermes produits à partir de laits isoprotéiques mais avec des ratios CN:WP différents, ≥ 3 :1 ou ≤ 2 :5. Les yogourts étaient plus élastiques avec le ratio CN:WP le plus faible. Ils associent ce phénomène à la microstructure du produit, distinguant deux types de liens structurants : intra- ou inter-particulaires avec d’une part, les briques de constructions que sont les agrégats protéiques (liens intra-particulaires) et d’autre part les liens, ou ponts, (force électrostatique, interactions hydrophobes…) qui cimentent le gel.

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