Propriétés physico-chimiques des chitosanes natif et fonctionnalisés

III.5.1. Taille des particules

La distribution de taille des particules est déterminée par diffusion statique de la lumière grâce à un granulomètre Malvern Mastersizer S (Malvern Instruments Ltd, UK). L’appareil est équipé d’un laser de type He/Ne d’une puissance de 5 mW et opérant à une longueur d’onde de 632,8 nm. L’optique est composée d’une cellule de mesure de 0,5 mm sur laquelle est montée une lentille de type 300RF possédant une distance focale de 0,45 mm. L’intensité lumineuse diffusée par l’échantillon est récupérée par 42 photodiodes localisées à différents angles. L’acquisition est réalisée à l’aide du logiciel de traitement Malvern (Sizer Sv2.17) qui permet la récupération et l’analyse des données brutes.

La distribution de taille des particules est suivie dans de l’eau distillée filtrée (Millipore, membrane diamètre 0,22 µm). 0,25 g de poudre du chitosane sont mis dans 100 mL d’eau distillée pour obtenir une solution en suspension. Cette concentration permet l’obtention d’une obscuration satisfaisante. La répartition de taille est mesurée en fonction de la distribution volumique des particules (%).

III.5.2. Degré d’acétylation (DA)

Le degré d’acétylation (DA) est l'expression du pourcentage moyen des groupements amines acétylés dans le chitosane. Plusieurs méthodes ont été rapportées pour déterminer ce DA, telles que l’UV, l’IR, la RMN, la CPG, la titration ou le dosage de l’acide acétique.

Dans notre travail, nous avons utilisé deux méthodes pour confirmer les valeurs DA des échantillons des chitosanes. La première méthode est le dosage spectrophotométrique proposé par Liu et ses collèges (Liu D. et al., 2006), basé sur la constatation que les absorptions maximales de la glucosamine (GlcN), de l’acétylglucosamine (GlcNAc) et du chitosane sont identiques et égaux à 201 nm. Pour cette expérience, 122 mg de chitosane est dissout dans 9,8 ml d'une solution d’HCl à 37 % en laissant sous agitation pendant 1h45 min à la température de 60°C. La solution obtenue est complétée à 1 L avec de l'eau distillée, de façon à ce que l'on ait une solution de chitosane de concentration 0,1M. L'absorbance de cette

solution est mesurée à 201 nm. Donc, le degré d’acétylation est calculé par l’équation suivante (9) :

DA (%) = (161,1 * A * V – 0,0218 * m) / (3,3615 * m – 42,1 * A * V) Équation 9 161,1 = MM GlcN; 42,1 = MM GlcNAc (203,2) – MM GlcN (161,1); A = absorbance à 201 nm; m = masse du chitosane en mg; V = volume de la solution en litre.

La deuxième méthode est l’IR (Brugnerotto et al., 2001b), basé sur la proposition entre deux absorptions à 1320 et 1420 cm^-1. Selon les résultats d’IR des chitosane natif et fonctionnalisés, le degré d’acétylation est calculé par l’équation suivante (10):

DA% = 31,92 * A1320 / A1420 – 12.20 Équation 10

III.5.3. Masse molaire (MM)

Une chromatographie d’exclusion stérique couplée à la diffusion de la lumière laser à multiples angles (SEC-MALLS) est utilisée afin de déterminer la masse molaire des chitosanes natif et fonctionnalisés, selon la méthode décrite par Nguyen et ses collèges (Nguyen et al., 2009).

La chromatographie d’exclusion stérique (SEC) est une technique analytique fondée sur la rétention sélective des macromolécules en solution en fonction de leur taille. Cette technique permet d’estimer la masse molaire moyenne et la polydispersité des polymères par comparaison avec des polymères étalons. L’association des deux techniques (chromatographie d’exclusion stérique couplée à la diffusion de la lumière laser à multiples angles (SEC-MALLS)) permet d’évaluer précisément Mw (une masse molaire moyenne en masse), Mn (une masse molaire moyenne en nombre) et Ip (un indice de polydispersité).

Afin de préparer une solution de concentration précise, les échantillons de chitosane sont mis 24 h à l’étuve à 60°C et le poids sec de l’échantillon est déterminé. Les solutions de chitosane (1mg/ml) sont préparées dans une solution (acide acétique 1 % - méthanol 100 % (3 :1)) à température ambiante. Les échantillons sont filtrés avec un filtre stérile de 0,2 µm (Acrodisc^® Seringue Supor PALL Membrane^®). La solution de solubilisation des échantillons

est même utilisée comme phase mobile de SEC. La phase mobile est filtrée avant l’utilisation par une membrane Durapore^® hydrophile à 0,45 µ m (47 mm de diamètre, Millipore).

Les analyses sont réalisées à température ambiante avec un débit de 0,7 mL/min et un volume d'injection de l'échantillon de 100 µ L en utilisant une colonne de gel TSK, 7,8 mm de diamètre et 30 cm de longueur. Les chitosanes de masses moléculaires différentes sont utilisés comme standard afin de déterminer les masses moléculaires des chitosane natif et fonctionnalisés.

III.5.4. Quantité des composés phénoliques greffés sur le chitosane fonctionnalisé

Le dosage des phénols est réalisé selon la méthode décrite par Singleton et ses collèges (Singleton et al., 1998) avec des modifications mineures. Après 4h de réaction enzymatique, les chitosanes fonctionnalisés sont récupérés en utilisant un filtre 0,2 µm (Ministar-RC membranes, Sartorius) sous vide. Ces chitosanes sont ensuite lavés par l’eau distillée, le méthanol, l’éthanol et l’acétone afin d’éliminer toutes les traces des phénols adsorbés par les liaisons électrostatiques. Enfin, la solution recueillie (milieu réactionnel initial avec les solvants de lavage) est utilisée afin de quantifier les phénols non-greffés.

En bref, 1 ml de solution recueillie est mélangé avec 1 ml de carbonate de sodium à 10 % (Na2CO3) et puis ce mélange est laissé pendant 10 min à 38 °C. Plus tard, 1 mL de réactif de Folin-Ciocalteau (1/3) est ajouté à ce mélange et puis ce mélange est agité pendant 15 min à l’abri de la lumière à température ambiante. L'absorbance est mesurée à 660 nm en utilisant un spectrophotomètre UV-visible (Shimadzu UV-1605). L'acide gallique (40 µg/mL) et l’eau distillée sont utilisés comme standard et blanc, respectivement. La teneur en composés phénoliques est calculée par l'équation suivante traduite de l'acide gallique comme standard (11):

y = 0,009 x (R² 0,9997) Équation 11

Où, y est la valeur de l’absorbance à 660 nm et x la concentration du phénol non-greffé (mg/mL).

III.5.5. Concentration des groupements amines libres

Basé sur les résultats d’IR des chitosane natif et fonctionnalisés, nous avons calculé la concentration des groupements amines libres par l’équation suivante (12) :

[-NH2] mol/L = Cp* DDA / (100. M) Équation 12

Où, M est la masse molaire d’un motif moyen (g/mol), DDA est le degré de désacétylation du chitosane (%), Cp (1 %, p/p) est la concentration de chitosane utilisé dans la méthode IR

La masse molaire d’un motif moyen (M) de chitosane compte tenu du degré de désacétylation est calculé par l’équation suivante (13) :

M = Md * DDA + Ma * DA = 168 g/mol Équation 13

Avec la masse molaire d’un motif déacétylé (Md) = 161 g/mol, la masse molaire d’un motif acétylé (Ma) = 203 g/mol.

III.5.6. Mobilité électrophorétique

La mobilité électrophorétique (µM cm/Vs) est mesurée afin de déterminer l'efficacité du greffage. Pour la mesure, les échantillons de chitosane sont dissous à une concentration de 2 mg/mL dans l'acide acétique (1 % v/v), à pH 3 et puis filtrés soigneusement en utilisant un filtre 0,2 µm (Ministar-RC membranes, Sartorius) sous vide avant l'analyse. Toutes les mesures sont réalisés à 25 ± 0,1°C en utilisant un appareil de type Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Angleterre) équipé d'un laser vert (532 nm Type : doublé en fréquence DPSS). Chaque mesure est répétée trois fois et la moyenne des mobilités électrophorétiques est enregistrée.

III.5.7. Viscosité

Les chitosanes natif et fonctionnalisés par les produits d’oxydation enzymatique de l’acide férulique et de l’éthyle férulate, à différentes concentrations (2-10 mg/mL) sont dissous dans l’eau à 1 % d'acide acétique (pH= 3). La viscosité de ces solutions est mesurée à

température ambiante en utilisant le viscomètre Stresstech de marque Reologica (taux de rotation fixé à 0,15 s^-1).

III.5.8. Stabilisation thermique

Afin de vérifier la stabilité thermique des chitosanes fonctionnalisés, une solution de chitosane fonctionnalisé (5 mg/ml dans 1 % d’acide acétique) est incubée aux températures de 50 et 100°C en conditions aérobies pendant 60 minutes selon la méthode décrite par Pasanphan (Pasanphan et al., 2010). Puis, le test antioxydant DPPH est réalisé par ajout de 200 µ L de solution de chitosane à 1800 µ L de solution méthanolique DPPH (6.10^-5 M). Ce mélange est homogénéisé pendant 15s et puis incubé à la température ambiante à l’abri de la lumière 30 min. Enfin, l’absorbance de ce mélange est mesurée à 517 nm en utilisant un spectrophotomètre UV-visible de marque Shimadzu UV-1605. Le pourcentage d’inhibition de la formation des radicaux DPPH^•libres est calculé selon la formule suivante (14):

(%) d’inhibition DPPH = 1-(Abs _{molécules à tester} / Abs _{100 % DPPH}) * 100 Équation 14

Abs molécules à tester :absorbance de la solution des molécules à tester en présence du DPPH,

Abs _{100% DPPH} : absorbance de la solution contenant uniquement la solution de DPPH

III.5.9. Morphologie de la surface

La microscopie électronique à balayage (Hitachi SEM S2500) à 10 kV est utilisée afin d’étudier la surface des films et des particules des chitosanes natif et fonctionnalisés. Les particules de chitosane fonctionnalisé sont bien séché au préalable et stockés au dessiccateur. Ensuite, ces particules sont placées sur la surface plastique fixée au support (Bio-Rad type SC 502). La mesure est réalisée pour différentes magnifications (150x, 300x, 1000x et 2500x).