Activité cytotoxique des produits d’oxydation

L’activité cytotoxique a été évaluée sur les produits d’oxydation, ainsi l’acide férulique et l’éthyle férulate. Des concentrations différentes entre 2 et 8 mg/mL d’acide férulique, d’éthyle férulate et du mélange des produits d’oxydation sont dissous dans du DMSO, avec une concentration finale en DMSO dans le milieu de culture ne dépassant pas 1 % (v/v) pour les cellules Caco2 et 0,25 % (v/v) pour les cellules HUVEC.

VI.4.1. Suivi de la croissance cellulaire à micro-échelle par le système cellscreen®

L'influence des molécules testées est évaluée sur la croissance des cellules à microéchelle et mesurée à l'aide de l'appareil Cellscreen^® (Innovatis AG, Allemagne) (Viebahn et al., 2006). En pratique, les cellules sont réparties dans une microplaque Nunc de 96 puits (8x12) à fond plat dont 8 puits sont ensemencés pour chaque condition à raison de 1.10⁴ cellules/puits (200 µL de milieu DMEM pour les cellules Caco2 ou ECGM pour les cellules HUVEC). La microplaque est incubée à 37°C dans une atmosphère enrichie à 5 % de CO2 pendant 24 h. Après 24 h, un tapis cellulaire adhérent est obtenu et 5 µL de molécules testées de concentrations comprises entre 2 et 8 mg/mL sont ajoutées afin d'obtenir des concentrations finales entre 50 et 200 µg/mL. La croissance des cellules est alors analysée à l’aide du système Cellscreen^®. Le témoin correspond à des cellules cultivées dans du milieu additionné uniquement du solvant utilisé pour solubiliser les molécules.

Système Cellscreen^®

La croissance du tapis de cellules au fond du puits peut être évaluée par le système Cellscreen^®. Ce système automatisé (Figure 35) permet à partir d’un microscope et d’un système de photographie numérique, de prendre des photos des cellules dans une microplaque et de déterminer par analyse d’images le pourcentage de recouvrement de la surface d’un puits (Brinkmann et al., 2002).

Figure 35 : système automatisé d’analyse de la croissance cellulaire : Cellscreen^® (Innovatis , Allemagne)

La détermination du pourcentage de recouvrement en fonction du temps permet d'obtenir une estimation cinétique de la croissance cellulaire. En effet, il a été vérifié que la surface de recouvrement est proportionnelle à la concentration cellulaire. Les mesures sont effectuées aux temps 0 (temps d’ajout les molécules), 24 h et 48 h et permettent le calcul de la vitesse spécifique de croissance (en h ^-1). La vitesse spécifique de croissance par heure (µ en h^-1) est calculée par l’équation suivante (18) :

Ln X/X₀ = µ * (t-t₀) Équation 18

• au temps t₀ la concentration de cellules dans le milieu de culture est X₀ • au temps t la concentration cellulaire dans le milieu est X.

En traçant, Ln X/X₀ en fonction de temps, la pente qui est déterminée à partir de la partie linéaire représente la vitesse spécifique apparente de croissance µ (h^-1) entre t₀ et t.

Le suivi de la croissance par le Cellscreen^® est basé sur la comparaison du pourcentage de recouvrement des puits “témoins” où les cellules ne sont pas mises en présence de la molécule à tester et des puits où les cellules sont soumises à différentes concentrations de la molécule.

Support motorisé

sur lequel la plaque est placée Microscope

VI.4.2. Evaluation de la viabilité cellulaire

La cytotoxicité éventuelle des molécules étudiées vis-à-vis des cellules Caco2 et des cellules HUVEC en culture est déterminée en utilisant le test au Rouge Neutre ou NRU (Neutral Red Uptak).

Un premier test a été envisagé consistant en la mesure de la viabilité par le test MTT qui est basée sur la transformation des sels de tétrazolium (jaunes) en cristaux de formazan (bleus) par des enzymes mitochondriales comme la succinate déshydrogénase active dans les cellules vivantes (Maher et McClean, 2006). Cependant, il est important de signaler que les sels de tétrazolium peuvent être directement transformés en cristaux de formazan en présence de certains flavonoïdes (Peng L. et al., 2005b). Le test MTT est impossible à utiliser lors de test de cytotoxicité en présence de molécules présentant un pouvoir réducteur du MTT. C’est pourquoi, un autre test de viabilité basé sur un autre mécanisme a également été mis en œuvre tel que le test au rouge neutre.

Test au Rouge Neutre

Le rouge neutre (Figure 36) est un colorant ionique qui peut pénétrer dans les cellules à travers la membrane cellulaire par diffusion ionique. Le colorant se fixe alors sur les membranes des lysosomes intracellulaires (Borenfreund, 1992). Cette fixation du rouge neutre témoigne de l’intégrité cellulaire et elle est relative à la viabilité. Ainsi, en cas de mortalité, la membrane dégradée des lysosomes ne permet pas la fixation du rouge neutre. L’absorbance à 540 nm mesurée par spectrophotométrie est directement proportionnelle à la quantité de cellules vivantes.

C

O

O H

N

N

N

C H

C H

En pratique, les cellules sont ensemencées comme décrit précédemment à raison de 1.10⁴ cellules/puits dans une microplaque de culture (Nunc) à 96 puits (8x12) et incubées pendant 24 h à 37°C et 5 % de CO_2. Après 24 h, les différentes concentrations de molécules à tester sont ajoutées. Après 48 h de culture, le milieu est éliminé, les cellules adhérées sont lavées au PBS, puis 200 µ L de rouge neutre à 50 µg/mL préparés dans le milieu de culture sont ajoutés et la microplaque est incubée pendant 3 h à 37°C. Le milieu est à nouveau éliminé et les cellules sont lavées au PBS. Le rouge neutre est extrait des cellules en les soumettant à une solution de solubilisation (éthanol / acide acétique / eau, 50/1/49 v/v/v) sous agitation pendant 15 min à température ambiante. L’absorbance peut enfin être mesurée à 540 nm à l'aide d'un spectrophotomètre. Le nombre de cellules vivantes après traitement par la dose choisie de molécules par rapport au nombre de cellules témoins non traitées, permet d’évaluer la cytotoxicité de ces molécules. Le pourcentage de mortalité est calculé par l’équation suivante (19):

% de viabilité cellulaire = 1-(Abs essai/ Abs témoin) * 100 Équation 19

Abs essai : absorbance de l’essai traité par les molécules, Abs témoin :absorbance du témoin non

traité par les molécules

L’activité cytotoxique des molécules testées est exprimée en CI50 qui correspond à la concentration de molécules induisant une diminution de 50 % de la concentration cellulaire.

VI.4.3. Analyse de l’apoptose et de la nécrose cellulaire

Cette analyse a été réalisée par cytométrie (Guava Easycyte^®) (Figure 37). Dans un premier temps, les cellules HUVEC ou Caco2 sont cultivées en présence des composés phénoliques pendant 48 h puis elles sont trypsinées et comptées et une suspension cellulaire est préparée à la concentration 10⁷ cellules/ml. Ensuite, 100 µL de l’échantillon sont placés dans une microplaque de 96-puits ainsi que 100 µ L de réactif (Guava Nexin^®, Millipore, 4700-1140). La plaque est laissée à l’obscurité pendant 20 min, puis analysée par le cytomètre. La population de cellules non apoptotiques témoin est issue d’un prélèvement d’une culture cellulaire en absence de composés phénoliques en conditions statiques.

Figure 37 : système (Guava Easycyte^®)

Le réactif Nexin^® contient de l’annexine V liée à la phycoérythrine (Annexin V-PE), et du 7-amino actinomycine D (7-AAD). L’annexine V se lie à la phosphatidyl-sérine (PS), un phospholipide de la face interne de la membrane plasmique, transloqué sur la face externe lorsque les cellules entrent en apoptose. Dû à une différence de potentiel de membrane, le 7-AAD ne diffuse pas à travers la membrane plasmique des cellules viables et en apoptose précoce, mais pénètre dans les cellules en apoptose tardive ou mortes (Figure 38). Enfin, le logiciel numérique nous donne les résultats exprimés par les pourcentages de chaque type de cellules (vivantes, apoptotiques précoces et apoptotiques tardives ou nécrotique).

Figure 38 : schéma de la distribution des cellules par cytométrie (Guava Easycyte^®)

Cellules viables Cellules en apoptose

précoce Cellules en apoptose tardive ou nécrose