Facteurs influençant l’activité des laccases

Les enzymes sont des catalyseurs biologiques spécifiques dont l’activité optimale varie selon plusieurs paramètres comme la source de l’enzyme, la nature et la quantité de produits formés, la nature des substrats, la qualité d’eau libre présente dans le milieu (ou activité de l’eau), le pH du milieu, la température et l’oxygène…

I.10.1. Influence du milieu réactionnel

L’influence du solvant est multiple sur la réaction enzymatique. En effet, le solvant affecte le catalyseur (les enzymes), les substrats et les produits de la réaction.

Les réactions catalysées par des laccases en milieu aqueux sont limitées à cause de la forte réactivité des quinones. En conséquence, cette activité provoque une polymérisation rapide et spontanée des intermédiaires (quinones, semiquinones) conduisant à la formation de polymères insolubles. Par ailleurs, le rendement de conversion des phénols diminue car l’activité élevée des quinones dans ce milieu cause l’inactivation de l’enzyme (Colombo et Carrea, 2002). Pour éviter cela, des agents réducteurs peuvent être utilisés comme l’acide ascorbique afin de réduire les o-quinones en o-dihydroxy phénols (Burton, 1994).

Par ailleurs, en milieu organique, le solvant permet d’augmenter la solubilité des substrats. Il permet également de faciliter la séparation (enzyme /produits) grâce à l’insolubilisation des enzymes en phase organique, ce qui diminue l’inhibition des enzymes par les produits (Burton et al., 1998). Par contre, ce milieu peut provoquer la dénaturation et/ou l’inhibition des enzymes par certains solvants organiques comme le méthanol (Bogdanovskaya et al., 2002) ou la diminution de l’activité enzymatique par un milieu diphasique (Mustafa et al., 2005).

Cependant, une faible quantité d’eau en milieu organique est nécessaire pour conserver l’activité enzymatique. En effet, l’eau permet de conserver la conformation tridimensionnelle de l’enzyme sous sa forme active car l’eau participe à toutes les liaisons non covalentes et aux liaisons hydrogène dans la structure de la protéine. De plus, l’eau entoure les zones chargées et polaires à la surface de l’enzyme (Diaz-Garcia et Valencia-Gonzalez, 1995). La quantité

minimale d’eau nécessaire en milieu organique pour la biocatalyse enzymatique varie selon l’enzyme et les conditions de la réaction (Vermuë et Tramper, 1995). Généralement, l’augmentation de la quantité d’eau dans le milieu organique accroît l’activité enzymatique (Burton, 2003 a)

Le solvant influence également le nombre des produits d’oxydation. Par exemple, Mustafa et ses collèges (2005) ont utilisé la laccase de Myceliophthora thermophila pour oxyder l’acide férulique dans un milieu aqueux et un milieu diphasique (acétate d’éthyle 80% - tampon phosphate 20%). Ils ont identifié dix produits d’oxydation dans le milieu aqueux et trois produits d’oxydations dans le milieu diphasique (Mustafa et al., 2005).

I.10.2. Influence du pH

L’activité enzymatique dépend du pH en milieu aqueux. De même, en milieu organique, l’activité dépendrait du pH de la solution aqueuse initiale dans laquelle l’enzyme a été préparée (Mustafa et al., 2005). Le pH d’activité enzymatique optimal dépend généralement du type d’enzyme (Xu, 1997). Dans la réaction catalysée par les laccases, le potentiel redox des partenaires de la réaction devrait être dans l’ordre suivant (2) (Xu, 1997):

E° (Substrat) ≤ E° (Enzyme) ≤ E° (O₂/H₂O) Équation 2

L’affinité des laccases envers leurs substrats varie généralement selon de pH du milieu, et le changement de pH influence le potentiel redox des trois partenaires :

1- Enzyme : le potentiel redox des laccases change avec le pH. Par exemple, le potentiel redox de la laccase de Myceliophthora thermophila diminue quand la valeur de pH augmente de 2,5 à 5. En ce cas, son activité diminue parce que le potentiel du substrat est plus important que celui de l’enzyme. Au contraire, le potentiel redox de cette enzyme augmente quand la valeur de pH augmente de 7 à 11 et donc son activité s’élève (Xu, 1997).

2- Substrat : à pH élevé, les phénols s’ionisent et perdent un proton ce qui conduit à la diminution de leur potentiel redox. Par contre, la fixation des ions hydroxyles OH^- sur le cuivre du site actif (type 2 ou 3) des laccases à pH élevé, pourrait inhiber l’activité

enzymatique car il empêche le transfert interne d’électrons du cuivre T1 au cuivre T2/T3 de l’enzyme (Xu, 1997).

3- Oxygène : quand la valeur de pH augmente jusqu'à 11, le potentiel (O₂/H₂O) diminue. Donc, le ∆E° entre le couple (O₂/H₂O) et Cu (T2/T3) diminue. Cela conduit à la diminution de la vitesse de transfert des électrons du cuivre dans le site actif de l’enzyme à l’oxygène et donc, à une diminution de la vitesse de réaction enzymatique (Xu, 1997).

I.10.3. Influence de la température

La température est un paramètre essentiel pour les réactions enzymatiques. En général, l’augmentation de la température devrait activer l’enzyme, cependant des températures élevées (plus de 50°C) peuvent provoquer une dénaturation de la protéine enzymatique et aussi diminuer la solubilité de l’oxygène dans le milieu réactionnel (Weiss, 1970). De plus, l’augmentation de la température peut entraîner la dégradation de certains produits d’oxydation ou la formation de produits secondaires. En général, la thermostabilité de l’enzyme dépend de plusieurs facteurs :

1- la structure de l’enzyme : la thermostabilité dépend de la structure quaternaire et elle

augmente avec le nombre de ponts disulfures dans la protéine enzymatique. Par exemple, les laccases provenant de champignons thermophiles (comme la laccase de

Myceliophthora thermophila) sont plus stables que celles de champignons mésophiles

(Xu, 1996).

2- La nature du milieu : en milieu organique, la thermostabilité de l’enzyme est plus

élevée que celle en milieu aqueux parce que les molécules d’eau libre participent à la dénaturation thermique de l’enzyme (Xu, 1996).

3- La formulation de l’enzyme : les enzymes immobilisées sont plus thermorésistantes

que les enzymes libres (Duran et al., 2002).

4- Le pH du milieu : par exemple, la thermostabilité de la laccase de Myceliophthora thermophila est plus importante en milieu alcalin ou neutre qu’en milieu acide Ce

résultats n’a pas été observé pour la laccase de Trametes villosa qui est stable à pH compris entre 4,5 et 6,5 (Xu, 1996).

I.10.4. Influence de l’oxygène

Généralement, l’oxygène est consommé à la fois par l’enzyme et par les produits d’oxydation durant les réactions non-enzymatiques. L’oxygène joue le rôle d’accepteur d’électrons de cuivre (T2/T3). Donc, l’oxygène est nécessaire pour l’oxydation du cuivre (Cu⁺¹ à Cu⁺²), l’activation et la régénération du site actif de l’enzyme (Burton et al., 1993). La vitesse de l’oxydation dépend de la teneur initiale d’oxygène dans le milieu (Lacki et Duvnjak, 1996). De plus, la méthode utilisée pour l’introduction de l’O2 dans le milieu réactionnel peut causer une désactivation de l’enzyme. En effet, les forces interfaciales (gaz-liquide) perturbent l’activité enzymatique. Pour cette raison, l’ajout d’O₂ en limitant les bulles de gaz dans le milieu réactionnel est préférable à l’activité enzymatique (Rissom et al., 1997).