Adhésion cellulaire des films de chitosane

Un objectif de ce travail est d’étudier les interactions des cellules Caco2 ou des cellules HUVEC avec des films de chitosane natif et fonctionnalisé. En effet, une interaction convenable permettant l'adhésion des cellules Caco2 ou des cellules HUVEC sur les films de chitosane est cruciale pour permettre une croissance de ces cellules sur ces films.

A cette fin, l’étude s'est focalisée sur l’étude de l’adhésion et de la croissance de cellules Caco2 ou de cellules HUVEC sur les films de chitosane en fonction du type de chitosane (natif ou fonctionnalisé), de l’épaisseur des films et de la quantité de phénols greffés sur le chitosane fonctionnalisé. La culture des cellules Caco-2 ou des cellules HUVEC a été effectuée comme décrit dans le paragraphe précédent (VI.3).

VI.5.1. Fabrication des films de chitosane dans une plaque 24 puits

A partir de chitosane fonctionnalisé ou de chitosane natif sous forme solide, des films sont préparés en dispersant 5 mg de chitosane dans 100 mL d’acide acétique (1 %). La solution obtenue est maintenue sous légère agitation magnétique à température ambiante pendant la nuit. La solution obtenue est ensuite filtrée sous vide pour garantir l'absence de particules insolubles de chitosane. Les films sont préparés en fonction de la quantité de chitosane et de la quantité de phénols comme le suivant : 1 (ou 3 mL) de solution du chitosane natif ou fonctionnalisé est ajouté dans chaque puits afin d’obtenir des films de différentes épaisseurs. De plus, différents films sont élaborés en fonction de la quantité de phénols greffés sur le chitosane fonctionnalisé par l’ajout de chitosane fonctionnalisés soit après 4 h soit après 16 h de temps réactionnel.

Les films sont séchés à température ambiante pendant approximativement deux jours pour assurer l’évaporation complète du solvant. Les films ainsi formés sont neutralisés par une solution de NaOH (1M) pendant 1 h afin d’obtenir des films résistant à l’eau. Les films sont ensuite rincés à l’eau distillée plusieurs fois pendant 30 min à température ambiante jusqu’à atteindre un pH entre 7-8. Enfin, les films sont séchés pendant 24 h à température ambiante et stockés dans du tampon PBS (9,6 g/L ; pH 7,2).

VI.5.2. Caractérisation des films de chitosane

Epaisseur des films

A priori, les films fabriqué dans la plaque 24 puits sont décollé, puis l'épaisseur de ces films est déterminée selon la norme NF Q 03-016 avec un micromètre manuel (Messmer, Londres, Angleterre) (Figure 39) équipé d'une tête de mesure 5 mm de diamètre avec une sensibilité de 2 µm. L'épaisseur est mesurée en 5 points choisis au hasard sur chaque film et ensuite une valeur moyenne est calculée.

Figure 39 : micromètre manuel (Messmer, Londres, Angleterre) Adsorption de protéine sur les films

L'adsorption des protéines du milieu de culture cellulaire sur les films de chitosane est évaluée d’après la méthode Holmes (Holmes et Tabrizian, 2011). En effet, la plaque contenant des films de chitosane est incubée avec le milieu de culture cellulaire complet soit DMEM supplémenté avec 5% de sérum de veau fœtal pour les Caco2 soit ECGM pour les HUVEC à 37°C et 5 % de CO2. Un témoin est réalisé dans un puits vide sans film. Après incubation pendant une nuit, le milieu de culture est éliminé, et les films sont rincés trois fois par du tampon PBS (pH 7,2). Le milieu de culture éliminé ainsi que le tampon PBS de rinçage sont ensuite placés ensemble dans un tube afin d’évaluer la quantité de protéines non-adsorbées sur les films par dosage protéique par la méthode de l'acide bicinchoninique (BCA) qui est décrit dans le paragraphe précédent (II.2.1)

VI.5.3. Mise en culture des cellules sur les films de chitosane

Dans un premier temps, les plaques 24 puits avec les films formés sont stérilisés sous UV rayons pendant 30 min. Les cellules Caco2 ou les cellules HUVEC sont ensuite ensemencées dans chaque puits soit sur les films de chitosane soit sur le polystyrène directement sans film (témoin) à raison de 5.10⁴ cellules/mL (1 mL de milieu DMEM supplémenté avec 10 % de SVF pour les cellules Caco2 ou ECGM pour les cellules HUVEC). Les plaques sont incubées pendant 3 jours à 37°C sous 5 % de CO2.

Pour pouvoir caractériser l’adhérence, l’étalement et la croissance des cellules Caco2 ou des cellules HUVEC, des photos sont réalisées à l’aide d’un appareil photo (Canon) fixé sur un microscope optique. Les photos des cellules Caco2 ou HUVEC sur les films de chitosane ou sur le témoin ont été prises chaque jour pendant 3 jours de culture.

VI.5.4. Evaluation de la viabilité cellulaire

Un test de viabilité a été réalisé en fin d'expérience (3 jours). La quantité de cellules des puits avec film « essais» est comparée aux puits « témoins» (sans film). . Le test Rouge neutre ne peut pas être utilisé ; en effet, la solution de solubilisation (éthanol/acide acétique/eau, 50/1/49 v/v/v) solubilise également les films de chitosane. C’est pourquoi, un autre test de viabilité basé sur une autre solution de solubilisation a également été mis en œuvre tel que le test MTT.

Test au MTT

La viabilité cellulaire des films vis-à-vis de cellules Caco2 et de cellules HUVEC en culture a été déterminée en utilisant le test MTT (3-(4,5-diméthyle thiazol-2-yl) -2,5 diphényle tétrazolium bromide qui permet d'évaluer l'activité mitochondriale des cellules (Maher et McClean, 2006). En effet, grâce à une enzyme (la succinate déshydrogénase mitochondriale active dans les cellules vivantes), qui a la propriété de catalyser la réduction du succinate en fumarate dans le cycle de Krebs, le sel de tétrazolium MTT de couleur jaune est réduit en cristaux bleus de formazan (Figure 40). Cette réduction et par conséquent l'activité mitochondriale pourra être évaluée à 540 nm.

N N N N S N CH₃ 3 CH HN N N N S N 3 CH CH₃ Réductases mitochondriales M T T _Formazan

De couleur jaune _{De couleur bleue}

+

Figure 40 : réduction du MTT en formazan

En pratique, après 72 h de culture, les puits sont vidés et les films sont lavés au PBS, puis 800 µ L de DMEM + 200 µL de MTT (à 2 g/L) sont ajoutés sur les films. La plaque est incubée pendant 4 h à 37°C, 5 % CO2. Après incubation, les puits sont vidés, lavés au PBS et les cristaux de formazan formés sont solubilisés par 1ml d’isopropanol. La plaque est agitée 15 min à l’abri de la lumière puis la mesure de l’absorbance à 540 nm est réalisée par spectrophotométrie (multiscan GO W382TA, Thermo Scientific MIB, France). La mesure de l'activité mitochondriale des cellules après traitement par les films de chitosane par rapport à l'activité mitochondriale des cellules sans film, permet d'évaluer indirectement la cytotoxicité de ces films. Le pourcentage de mortalité est calculé d'après cette équation (20):

% de viabilité cellulaire = 1-(Abs essai/ Abs témoin) x 100 Équation 20