Propriétés antioxydantes et antiradicalaires

Le pouvoir antiradicalaire ou antioxydant ne peut être mesuré qu’indirectement à partir de ses effets. La plupart des méthodes de mesure de l’activité antiradicalaire sont basées sur l’utilisation de systèmes générant des radicaux très variés. Ce sont principalement des

méthodes dites « d’inhibition » dans lesquelles une espèce chimique capable de générer des radicaux libres est utilisée avec une substance capable de réagir avec ces espèces.

Compte tenu de la complexité des processus d’oxydation, il n’existe pas de méthode unique qui permettrait de refléter le profil antioxydant ou antiradicalaire d’un échantillon. C’est pourquoi, en effectuant différents tests de mesure de pouvoir antioxydant, on peut dresser un profil plus global des propriétés antioxydantes ou antiradicalaires des échantillons étudiés (Frankel et Meyer, 2000).

IV.1. Propriété antiradicalaire

Piégeage des radicaux DPPH^•

Le potentiel antiradicalaire d'une substance peut être testé à l’aide d’une méthode colorimétrique en utilisant des radicaux de substitution tel que le radical 1,1-diphényle-2-picrylhydrazyl appelé DPPH^• (Figure 33).

N N

NO

NO

2

O

N .

Figure 33 : structure chimique du DPPH^•

En effet, à température ambiante et en solution, le radical DPPH^• présente une coloration violette intense. Son passage à la forme non radicalaire, après saturation de ses couches électroniques s’accompagne d’une disparition de cette coloration selon l’équation suivante (15).

La diminution de l’intensité de la coloration est suivie par mesure colorimétrique à 517 nm. Elle rend ainsi compte du pouvoir piégeur des composés étudiés vis-à-vis du DPPH^•(Lee S. E. et al., 2003).

Les produits d'oxydation sont solubilisés dans du méthanol à des concentrations différentes et 50 µ L de ces solutions sont mélangés avec 1950 µL d’une solution méthanolique de DPPH^• (6.10^-5 M). Alors que les chitosane natif et fonctionnalisés sont solubilisés dans l’acide acétique 1% (v/v) à des concentrations différentes et 200 µL de ces solutions sont mélangés avec 1800µl de la solution méthanolique de DPPH^• (6.10^-5 M).

Ces mélanges sont fortement agités pendant 15s puis incubés pendant 30 min à température ambiante à l’abri de la lumière. L’absorbance du mélange est ensuite mesurée à 517 nm contre un blanc constitué par du méthanol pur (Shimada et al., 1992). Le trolox (acide 6-hydroxy-2,5,7,8-tétraméthylchroman-2-carboxylique), dont la structure moléculaire cyclique est similaire à celle de la vitamine E, a été utilisé à titre comparatif pour les produits d’oxydation.

Enfin, l’activité antiradicalaire des composés testés est évaluée par rapport à une solution méthanolique de radicaux DPPH^• qui représente le 100 %. Le pourcentage d’inhibition de formation des radicaux DPPH^•est calculé selon l’équation précédente (14).

L’activité antiradicalaire des produits d’oxydation est exprimée en valeur du TEAC (Trolox Equivalent Antioxydant Capacity) qui correspond à la concentration molaire de trolox permettant d’avoir le même pourcentage d’inhibition qu’une µM ou 1 g/L de produit, déterminée à partir des courbes d’inhibition en fonction de la concentration. Nous déterminons enfin la CI₅₀ qui correspond à la concentration de molécule testée nécessaire pour faire disparaître 50 % de radicaux DPPH^•.

Piégeage des radicaux ABTS^•+

L’activité antiradicalaire d’une molécule est déduite de sa capacité à inhiber le radical ABTS^•+. L’ABTS est une substance ne possédant pas de radicaux libre au départ. Après mélange avec du persulfate de potassium, des radicaux libres (ABTS^•+) se forment par

arrachement d’un électron à un atome d’azote de l’ABTS (Re et al., 1999). En effet, le mélange du persulfate de potassium et de l’ABTS provoque une oxydation incomplète de ce dernier faisant apparaître une coloration bleue intense.

Le contact entre le radical ABTS^•+ et un donneur d’hydrogène conduit à l’ABTS⁺ (Lien

et al., 1999) et à la décoloration de la solution (Figure 34). Cette décoloration sera suivie par

spectrophotométrie à une longueur d’onde de 734 nm.

N S N N N S ^SO3 O COOH CH₃ 3 CH H₃C HO CH₃ C₂H₅ 2H₅ C _ _ 3 SO + NH₄⁺ + 4 NH

ABT S : sel d'ammonium de l'acide 2,2'- az inobis - (3-éthy lbenzothiaz oline-6-sulfonique)

NH 4⁺ SO₃^{_ _}+ NH₄⁺ C_2H5 C2H₅ 3 SO N S N N N S + ABT S

.

(ou antioxy dant à tester donneur H )

3 CH O CH₃ 3 CH COOH O 3 HC + N S N N N S ^SO3 C₂H₅ 2H₅ C _ _ 3 SO + NH₄⁺ + 4 NH

.

+

.

.

Figure 34 : formation et piégeage du radical ABTS^•+ par un antioxydant donneur de H• (Lien

L’activité antiradicalaire des produits d’oxydation sera comparée à celle d’un antioxydant de référence, le trolox (acide 6- hydroxy-2, 5,7, 8-tétraméthylchroman-2-carboxylique), dont la structure moléculaire cyclique est similaire à celle de la vitamine E.

Le radical ABTS^•+ est le produit d’oxydation de l’ABTS (7 mM) par du persulfate de potassium (2,45 mM) en solution aqueuse. Une fois la solution préparée, il faut la laisser pendant une nuit à température ambiante et à l’abri de la lumière pour que la réaction ait le temps de se faire totalement. Il en résulte l’apparition d’une coloration bleue intense. La solution d’ABTS^•+ à 7 mM est diluée dans de l’éthanol afin d’obtenir une densité optique à 734 nm de l’ordre de 0,7± 0,02.

Des solutions de trolox ou des produits d’oxydation à des concentrations différentes sont préparées dans l’éthanol. Alors que des solutions des chitosane natif et fonctionnalisés à des concentrations différentes sont préparées dans l’acide acétique 1 % (v/v). Ensuite, 10 µL de ces solutions sont ajoutés à 1 mL de solution d’ABTS^•+, et après 15 min d’incubation à 30°C, on mesure l’absorbance à 734 nm à l’aide d’un spectrophotomètre (Re et al., 1999). Dans un premier temps, les résultats sont exprimés en pourcentage d’inhibition selon la formule suivante (16) :

(%) d’inhibition ABTS = 1-(Abs finale/ Abs initiale) * 100 Équation 16

Abs initiale : absorbance de l’ABTS^•+ qui est égale à 0,7 ± 0,02, Abs finale : absorbance de

l’ABTS^•+ en présence de la molécule testée

Dans un deuxième temps, l’activité antiradicalaire des produits d’oxydation est exprimée en valeur du TEAC (Trolox Equivalent Antioxydant Capacity) qui correspond à la concentration molaire de trolox permettant d’avoir le même pourcentage d’inhibition qu’une µM ou 1 g/L de produit, déterminée à partir des courbes d’inhibition en fonction de la concentration. Nous déterminons enfin la CI50 qui correspond à la concentration de molécule testée nécessaire pour faire disparaître 50 % de l'ABTS^•+ initial : plus cette valeur est faible, plus le composé est antiradicalaire.

IV.2. Propriété antioxydante

Pouvoir réducteur sur le ferricyanure de potassium

Le pouvoir réducteur d'une substance est associé à son activité antioxydante. Le pouvoir réducteur des chitosanes natif et fonctionnalisés a été évalué d’après la méthode d’Oyaizu (Oyaizu, 1986), basée sur la réaction chimique de réduction du Fer(III) présent dans le complexe K3Fe(CN)6 en Fer(II) comme suit :

2,5 mL de tampon phosphate (0,2 M, pH=6,6) et 2,5 mL de K3Fe (CN)6 (1 % w/v) sont ajoutés à 1ml de chaque concentration des chitosanes solubles dans l’acide acétique 1 %. Le mélange est ensuite incubé dans un bain-marie à 50°C pendant 20 min puis on y ajoute 2,5 mL d’acide trichloroacétique (10 % w/v). Ce mélange est ensuite centrifugé à 10000 g pendant 10 min. On prélève ensuite 2,5 ml du surnageant et on y ajoute 2,5 mL d’eau distillée et 0,5 mL de FeCl3 (0,1 % w/v). Enfin, l'absorbance du milieu réactionnel est mesurée à 700 nm. Une augmentation de l'absorbance correspond à une augmentation du pouvoir réducteur des molécules testées.