Enzymes utilisées en fonctionnalisation enzymatique

Figure 23 : mécanisme proposée de la fonctionnalisation du chitosane (méthode homogène) avec l’acide gallique par la laccase de Trametes versicolor (Bozic M. et al., 2012b)

III.4. Enzymes utilisées en fonctionnalisation enzymatique

Les enzymes pour la fonctionnalisation du chitosane sont sélectionnées sur la base de la structure chimique du chitosane (groupements fonctionnels). Ces enzymes sont principalement des enzymes oxydatives comme des peroxydases, des tyrosinases et des laccases. De façon secondaire, d’autres enzymes comme des transglutaminases, des phosphorylases et des lipases peuvent être utilisées.

Liaison ester

Interactions Électrostatique

- Peroxydases (POD) (E.C. 1.11.1.7)

Les peroxydases peuvent oxyder des composés phénoliques en présence de donneurs d’hydrogène en réduisant des peroxydes, notamment l’eau oxygénée; ils acceptent de nombreux donneurs d’hydrogène parmi lesquels les polyphénols qui sont liés au cycle aromatique par le couplage C-C et C-O des fragments phénoliques. Ces enzymes ont été exploitées en tant que nouvelle voie efficace pour la fonctionnalisation de polymères industriels.

Une peroxydase a été directement utilisée pour greffer un substrat phénolique comme le dodécyle gallate (DDG) (ester de l’acide gallique) (Vachoud et al., 2001) ou des flavonoïdes tels que la quercétine, la rutine… (Torres et al., 2012) sur du chitosane soluble dans le milieu réactionnel. La peroxydase a oxydé le dodécyle gallate en quinones à pH 4 qui ont été greffés sur le chitosane. Récemment, une peroxydase a été utilisée pour former un hydrogel soluble à pH neutre, biodégradable et injectable à base de chitosane modifié par voie chimique. En effet, dans un premier temps, le chitosane a été modifié par voie chimique par conjugaison avec des molécules par exemple, l’acide glycolique et phlorétique (Jin et al., 2009), l’acide 3-(p-hydroxyphényl) propionique (Sakai et al., 2009) et le polyéthylène glycol et la tyramine (Lih et al., 2012) pour améliorer la solubilisation du chitosane au pH physiologique de 7,4. Dans un deuxième temps, des peroxydases en présence de H2O2 ont été utilisées afin de former des hydrogels par polymérisation du chitosane modifié comme présenté dans la Figure 24.

Figure 24 : schéma de la formation d’hydrogel du (chitosane-polyéthylène glycol-tyramine)

conjugués en utilisant la peroxydase horseradish en présence de H2O2 (Lih et al., 2012) - Tyrosinases (EC 1.14.18.1)

Le greffage de composés phénoliques sur le chitosane par une tyrosinase a été rapporté par plusieurs auteurs. La tyrosinase peut catalyser l’hydroxylation des monphénols en o-diphénols et des o-o-diphénols en o-quinones correspondantes. Les produits issus des réactions catalysées sont électrophiles et capables de réagir avec les groupements nucléophiles. Ces quinones peuvent subir au moins deux types de réactions avec les groupements amines en donnant soit des bases de Schiff, soit des adduits de type michaélien comme présenté dans la figure 22. Ces composés phénoliques peuvent être des acides phénoliques tels que l’acide chlorogénique (Kumar et al., 1999), des esters phénoliques tels que l’octyle gallate et le dodécyle galate (Vartiainen et al., 2008), et des flavonoïdes tels que l’hespéridine, la quercétine, la catéchine, l’épicatéchine, la rutine, la fisétine, … (Fras-Zemljic et al., 2011 ; Sousa et al., 2009 ; Wu et al., 2002).

De plus, ces enzymes peuvent catalyser le greffage de composés d’origine protéique sur le chitosane. En effet, la tyrosinase peut catalyser l’oxydation de la tyrosine présente dans le

(chitosane-polyéthylène glycol-tyramine) En voie chimique

Hydrogel en voie enzymatique (chitosane-polyéthylène glycol-tyramine) Peroxydase horseradish

peptide ou la protéine en radicaux correspondants. Ces radicaux subissent un couplage avec les groupements amines du chitosane par voie non-enzymatique par des liaisons covalentes comme présenté dans la Figure 25.

Figure 25 : mécanisme réactionnel d'oxydation de la tyrosine par la tyrosinase en présence de chitosane (Anghileri et al., 2007)

Des auteurs (Aberg et al., 2004) ont utilisé une tyrosinase pour greffer des peptides produits par l’hydrolyse chimique de la caséine sur le chitosane au niveau des groupements amines par des liaisons covalentes à pH 6,5 et à température ambiante en 24h. De même, une autre étude a montré la possibilité de greffer des peptides de la séricine sur les groupements amines du chitosane. Le greffage enzymatique s’est déroulé en présence de la tyrosinase à pH 6,5 et à température ambiante en 24h. Ce greffage a conduit à renforcer les propriétés antibactériennes du chitosane avec un apport de nouvelles propriétés apportées par des peptides séricine (antioxydant, anti-UV, hydratation, solubilité, etc.) (Anghileri et al., 2007).

Par ailleurs, ces enzymes peuvent également catalyser le greffage de polymères d’origine protéique sur le chitosane afin de créer un copolymère (polysaccharide-protéine). Par exemple, la tyrosinase a catalysé le couplage entre la fibroïne de la soie du Bombyx du mûrier et le chitosane pour introduire les propriétés antibactériennes du chitosane dans les fibres de textile et renforcer la biocompatibilité de la soie dans le domaine biologique. Ce couplage s’est déroulé avec un rapport molaire (1.6 :1) de chitosane avec la fibroïne à pH 6,5

OH Résidus tyrosyle O O O - quinone O N Base de schiff O O N H

Adduit de type michaéluien Tyrosinase

O₂ Chitosan

et à température ambiante en 24h (Freddi et al., 2006 ; Sampaio et al., 2005). De même, une autre étude a montré que la tyrosinase pouvait également catalyser le greffage de chaînes de gélatine sur le chitosane. Cet hydrogel a été produit grâce à une tyrosinase qui catalyse l’oxydation des résidus tyrosyles de la gélatine à pH 6 et 35 °C en une nuit (Chen H. T. et al., 2002).

- Laccases (EC 1.10.3.2.)

Contrairement aux tyrosinases, les laccases sont capables d’oxyder des composés phénoliques o- ou p- diphénols via une réaction radicalaire aboutissant à la formation de semiquinones et/ou quinones correspondantes en présence d’oxygène moléculaire. De plus, elles ne possèdent pas l’activité monophénolasique (hydroxylation) qui est considérée comme la première étape dans le processus de mélanisation catalysé par les tyrosinases.

Ces enzymes ont été récemment utilisées afin de modifier les propriétés fonctionnelles du chitosane telles que des propriétés antioxydantes et antibactériennes par le greffage de phénols comme l’acide caféique, l’acide gallique, l’acide tannique et la quercétine sur le chitosane (Bozic Mojca et al., 2012a ; Bozic M. et al., 2012b).

- Transglutaminases (EC 2.3.2.13)

Les transglutaminases peuvent catalyser la formation de liaisons covalentes entre un groupement amine primaire comme celui de la lysine et le groupement amide (R-CO-NH2) des glutamines. Récemment, la transgutaminase a été utilisée pour obtenir un hydrogel produit par couplage entre le chitosane et la gélatine à pH 6 (Chen H. T. et al., 2003). Même si le chitosane n'est pas nécessaire pour obtenir un hydrogel stable à partir de la gélatine, sa présence a permis un processus de gélification plus rapide et l’obtention d’un hydrogel fort et résistant.

- Phosphorylases (EC 2.7.7)

Les phosphorylases sont les enzymes responsables de la phosphorolyse. Ils ajoutent un ion phosphate PO₄^3- (ou o-phosphate) à partir d'un ion hydrogénophosphate HPO₄^2- sur une

molécule organique lors d'une phosphorolyse. Ces enzymes ont été récemment utilisées afin de synthétiser des dérivés de chitosane soluble dans l’eau par le greffage de chaînes courtes d’amylose comme présenté dans la Figure 26.

Figure 26 : synthèse du chitosane-amylase dérivé à partir du chitosane-maltoheptaose dérivé par une méthode chemo-enzymatique (Matsuda et al., 2007)

D’abord, du maltoheptaose a été greffé sur le chitosane par voie chimique par l’amination réductrice en présence de sodium cyanotrihydroborate (NaBH₃CN) dans un mélange de 1 M d’acide acétique et de méthanol (1 :1 v/v) à température ambiante pendant 3 jours afin de produire un chitosane-maltoheptaose. Ensuite, l’élongation des chaînes α-glucane du chitosane-maltoheptaose est réalisée par voie enzymatique par la polymérisation catalysée via la phosphorylase en présence de α-D-Glucose 1-phosphate (G-1-P) afin d’obtenir du chitosan-amylose. La polymérisation enzymatique s’est déroulée en milieu tamponné d'acétate de sodium (pH 6,2) à une température de 40-45°C en 7 h (Kaneko et al., 2007 ; Matsuda et al., 2007 ; Yang et al., 2011).

chitosane Réaction chimique maltoheptaose Réaction enzymatique Chitosane-maltoheptaose dérivé Chaîne d’amylose Chitosane-amylose dérivé Phosphorylase

- Lipases (EC 3.1.1)

Les lipases sont des enzymes hydrosolubles capable d'effectuer l'hydrolyse de fonctions esters et sont spécialisées dans la transformation de triglycéride en glycérol et en acides gras (lipolyse). À ce titre, elles constituent une sous-classe des estérases.

Récemment, la lipase pancréatique porcine a été utilisée afin de conjuguer le chitosane avec l’acide polylactique (PLA) à 50°C. En conséquence, cette procédure a permis de synthétiser un nouveau copolymère (polysaccharide-polyester) présentant une bonne capacité d’adhésion et de prolifération cellulaire (Zeng et al., 2012). Ainsi, ce copolymère peut être appliqué comme un matériau d'échafaudage pour le génie tissulaire.